血管内皮生长因子受体3对宫颈癌细胞凋亡的效应研究

作者：刘琰，杨婉华，马湘一，陈睿，汪蕊，卢运萍，马丁，王世宣。

【摘要】 　　目的 研究血管内皮生长因子受体3（VEGFR3）在人宫颈癌细胞凋亡过程中的作用。方法 用基因重组方法构建人反义VEGFR3基因真核表达载体，用电穿孔法转染人宫颈癌细胞系Hela细胞。采用Western Blot分析转染前后细胞中VEGFR3蛋白的变化。利用Hoechst33258染色和流式细胞仪观察转染后Hela细胞的凋亡情况。结果 转染反义VEGFR3质粒后, Hela细胞VEGFR3的蛋白表达水平明显下降，细胞凋亡率明显增加(P0.01)。结论 抑制VEGFR3的表达可促进宫颈癌细胞的凋亡，VEGFR3可能是肿瘤基因治疗的一个潜在新靶点。

【关键词】 VEGFR3　反义核酸　凋亡；宫颈癌。

The Effect of Vascular Endothelial Growth Factor Receptor3 on the Apoptosis of Cervical Cancer。

Key words：VEGFR3；Antisense nucleic acid；Apoptosis；Cervical cancer。

血管内皮生长因子受体3(VEGFR3)属于酪氨酸激酶受体家族, 在胚胎发生的初始阶段存在于所有的内皮细胞，随后定位于小静脉和淋巴管，是成熟淋巴管内皮细胞的特异性标志物[1]。VEGFR3主要通过与其配体VEGFC、VEGFD结合后，促进淋巴内皮细胞的增殖、分化，诱导淋巴管生成，促进肿瘤细胞的侵袭和转移[2]。在肿瘤组织中可见肿瘤周边的新生淋巴管、扩张的淋巴管、有癌栓的淋巴管内皮细胞VEGFR3呈高表达[3]。

现有研究表明VEGFR3在多数肿瘤细胞上也有相应表达[4]，但关于其在肿瘤细胞中的效应及作用机制尚不清楚。我们自行设计了VEGFR3的反义重组质粒，通过电穿孔转染法瞬时转染人宫颈癌细胞株Hela细胞，观察反义封闭VEGFR3后Hela细胞凋亡情况的变化，对VEGFR3在宫颈癌细胞中的作用及其机制进行初步探讨。

1 材料与方法。

1.1 实验材料。

1.1.1 主要试剂与仪器 培养基DMEM、Trizol购自美国Gibco BRL公司；胎牛血清为杭州四季青生物工程公司产品；MMLV逆转录酶、pGEMT载体购自美国Promega公司；PCR引物购自上海博亚生物技术有限公司；兔抗人VEGFR3 多克隆抗体、兔抗人βactin多克隆抗体、HRP标记的羊抗兔IgG均购自美国Santa Cruz公司；ECL显色试剂盒购自美国Pierce公司。

1.1.2 细胞培养 人宫颈癌细胞株Hela购自美国典型物种保藏中心（ATCC）, 培养在含10％胎牛血清的DMEM中，置饱和湿度5％CO2，37℃恒温培养箱中培养。

1.2 VEGFR3反义核酸载体的构建。

1.2.1 VEGFR3目的基因的制备 根据NCBI Genebank 登录的VEGFR3的cDNA序列, 利用Primer5.0设计VEGFR3胞外1～3区的引物，上游引物设计BamHⅠ酶切位点，下游引物设计EcoRⅠ酶切位点，上游引物序列为：5’GGATCCGACGGCCTGGTGAGTGACTA3’下游引物序列为：5’GAATTCCTTTGAGCCACTCGACGCTGATGA3’。按Trizol说明书从胎盘组织中提取总mRNA(由华中科技大学同济医学院附属同济医院妇产科提供)，再以RTPCR方法大量扩增VEGFR3目的片断。PCR循环条件：94℃预变性5 min、94℃变性30 s、56℃复性30 s、72℃延伸45 s，共35个循环，全部循环结束后，于72℃做10 min终止前延伸。1%琼脂糖凝胶电泳检测，PCR产物纯化试剂盒纯化目的片断。

1.2.2 反义VEGFR3重组质粒的构建 按常规分子生物学方法，将目的基因和载体连接。连接产物转化，挑取阳性克隆, 小量摇菌后酶切初步鉴定、测序。

1.3 基因转染及细胞分组。

参考《分子克隆》采用电穿孔转染法，将电击完的细胞转移至已加入适量培养基的35mm培养皿中，培养皿置于含5％CO2的37℃孵箱, 24h后观察转染效率。

细胞分组：空白组（不做处理的Hela细胞），对照组（转染空质粒pGFPC1的Hela细胞），实验组（转染反义质粒的Hela细胞）。

1.4 WesternBlot分析转染前后细胞VEGFR3蛋白的表达。

分别提取空白组细胞、转染空载体及转染反义质粒48h的Hela细胞总蛋白，参考《分子克隆》实验方法，按ECL显色试剂盒说明书曝光成像。

1.5 转染细胞生物学效应的观察。

1.5.1 Hoechst33258观察转染前后细胞形态学的变化 将空白组、对照组和实验组的Hela细胞分别置于预先放入玻片的六孔板中，待24 h后取出玻片，PBS漂洗，固定，待干燥后由Hoechst33258室温避光染色30min，封片后荧光显微镜观察。

1.5.2 流式细胞法检测Hela细胞凋亡率 分别收集空白组、对照组和实验组48h后的Hela细胞，常规方法行PI染色后，上机检测。

1.6 统计分析 Hela细胞凋亡率以±s表示，用t检验在SPSS11.5统计软件上分析差异显著性，以P0.05为有统计学意义。

2 结果。

2.1 VEGFR3反义表达载体构建及鉴定。

用1％琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，970bp处有明显扩增条带，其大小与预期目的基因片段相吻合，构建的VEGFR3 反义表达载体经BamHⅠ，EcoRⅠ双酶切产生了两条带：载体pEGFPC1片断（4.7kb）和目的片断（970bp）。对酶切正确的质粒进行测序，结果表明其序列与插入方向正确，见图1。

1:1kb DNA 标准； 2:VEGFR3 PCR 产物 （970bp）；3:双酶切产生的条带，可见目的条带（970bp）和载体片断（4.7kb）。