绒柄牛肝菌有效部位指纹图谱定性和有效成分定量分析研究

作者：王元忠，刘鸿高，张金渝，李涛。

【摘要】 目的建立绒柄牛肝菌的反相高效液相色谱定性和定量分析方法。方法反相高效液相色谱（RP—HPLC） Planetsil C18分析柱（150 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为甲醇—水（15∶85），流速为1.0 ml·min—1，检测波长为261 nm，柱温为室温。对绒柄牛肝菌有效部位（甲醇提取部位）进行指纹图谱定性分析，对绒柄牛肝菌中的有效成分腺苷进行定量测定。结果在色谱条件下，11份不同绒柄牛肝菌中甲醇有效部位的RP—HPLC指纹图谱中可检出11个相对稳定的色谱峰，其中确定出9个共有峰作为定性鉴别的指标峰；绒柄牛肝菌中腺苷的含量为0.146%～0.493%。结论绒柄牛肝菌有效部位RP—HPLC指纹图谱定性和有效成分定量分析方法具有较强的针对性和准确性，可用于绒柄牛肝菌及药用真菌的质量控制。

【关键词】 绒柄牛肝菌； 腺苷； 指纹图谱； 反相高效液相色谱。

绒柄牛肝菌Boletus tomentipes Earle，又名大巴菌、黑牛肝、毛脚牛肝菌，属于担子菌亚门（Basidiomyctina）、层菌纲（Hymenomycetes）、伞菌目（Agaricase）、牛肝菌科（Boletaceae）中的一种［1］。我国主要分布于云南，生于针阔叶林中地上，散生。全世界已知的牛肝菌属约有1 024种或变种，我国已知的可食用的就有199种［2］。据文献记载，牛肝菌子实体富含蛋白质、碳水化合物、钙、磷、铁、核黄素等营养成分，含有人体必需的8种氨基酸，还含有腺嘌呤(adenine)、胆碱(choline)和腐胺(putrescine)等生物碱，可治疗腰腿疼痛、手足麻木、四肢抽搐，还可治疗妇女白带症［3］ 。牛肝菌子实体的水提物对小鼠肉瘤S180的抑制率达90%，对艾氏腹水癌的抑制率为80%，是中成药“舒筋丸”的原料之一［4］。 　　众多研究表明，同一物种不同个体由于来源和产地不同，其有效成分含量会有很大差异［5～7］。为了确保绒柄牛肝菌药理作用，本研究建立了以绒柄牛肝菌有效部位为基础的HPLC指纹图谱定性分析和有效成分定量分析方法，并通过对11个不同地区的样品分析测定研究，确定了绒柄牛肝菌指纹图谱的共有峰和指标峰以及腺苷的含量范围，为有效准确地定性和定量鉴别不同来源的大型药用真菌提供一种分析方法。

1 材料与方法。

1.1 仪器与试剂。

Shimadzu LC—2010A高效液相色谱仪, SPD—M10Avp二极管阵列检测器， CLASS—VP色谱工作站；色谱柱为Planetsil—C18 (4.6 mm×150 mm，5 μm) ；色谱柱恒温装置。超纯水器（Mill—Qplus USA）；KQ2200E型超声波仪（舒美超声仪）；AE100S万分之一电子天平（梅特勒－托利多）。

流动相甲醇为色谱纯（Fisher公司 美国）；水为三重蒸馏水（自制）；对照品腺苷（中国药品生物制品检定所提供）。其余所用试剂均为分析纯。

1.2 材料来源。

见表1。表1 实验材料（略）。

1.3 样品制备腺苷标准溶液：精密称取经五氧化二磷减压干燥至恒重的腺苷标准品，加甲醇制成每毫升含20 μg的溶液，作为对照品溶液。 　　取样品粉碎混匀，准确称取0.500 0 g试样（精确至0.000 01 g）于心形瓶中，精密加90%甲醇10ml，70℃水浴回流提取30 min，放冷，再称定重量，用90%甲醇补足减失的重量，摇匀，以5 000 r/min离心5 min。经0.45 μm滤膜过滤后供液相色谱分析用。

2 结果。

2.1 色谱条件色谱柱为Planetsil—C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）及其C18保护柱。流动相A为甲醇、流动相B为水；梯度洗脱；流速1 ml/min；检测波长261 nm；柱温30 ℃；进样量10 μl。

2.2 分析方法学考察结果。

2.2.1 系统适应性实验吸取对照品溶液5 μl注入色谱仪，记录色谱图，理论塔板数按腺苷计算在5 000以上。在此条件下对腺苷对照品溶液，供试品溶液进行测定，供试品溶液色谱图中与对照品溶液色谱图相同位置具有吸收峰，且对照品测定无干扰。

2.2.2 线性关系考察。

精密吸取2，4，6，8，10，12，14，16μl腺苷对照品溶液，按上述条件分别进样，以腺苷浓度（mg/ml）为横坐标，峰面积为纵坐标，得回归方程：Y=1.46×106 X—1.22×105，r2 =0.999 69，(n = 7),表明腺苷在1.2～ 96 μg/ml范围呈良好的线性关系。