子痫前期患者胎盘、胎膜组织中水通道蛋白9的表达变化
【摘要】目的：观察水通道蛋白9（AQP9）在子痫前期患者胎盘、胎膜组织中的定位、mRNA及表达变化，分析AQP9在子痫前期发病中发挥的作用。
方法：选取本院2014年3月至2015年5月收治的100例孕妇作为研究对象，其中有50例为正常晚期妊娠孕妇，将这50例作为对照组；另外50例为子痫前期孕妇（孕周38～42周），轻度子痫前期孕妇与重度子痫前期孕妇各25例，将这50例子痫前期患者作为观察组。
利用免疫组织化学增强聚合物法对AQP9的定位情况进行测定；利用逆转录—聚合酶链反应对AQP9 mRNA进行检测；利用蛋白印迹技术对蛋白的表达水平进行检测；通过使用凝胶蛋白定量分析软件对蛋白灰度值进行测定。
结果：（1）AQP9在羊膜上皮细胞、绒毛膜滋养细胞和合体滋养细胞上定位；（2）两组患者的胎膜组织和胎盘中都有AQP9 mRNA表达；（3）观察组胎膜组织、胎膜中AQP9的灰度值都要高于对照组，差异显著，具有统计学意义（P毕业论文网 【关键词】子痫前期；胎盘；胎膜组织；AQP9；表达变化 Expression of aquaporin—9 in placenta and fetal membrane of preeclampsia patientsBAI Lingli， LU Di， GAO Xia. Department of Obstetrics， Hospital Affiliated to Yan’an University， Yan’an 716000， Shaanxi， China 【Abstract】Objectives： To observe changes in the location， mRNA and expression of aquaporin—9 （AQP9） in placenta and fetal membrane of preeclampsia patients， to analyze its role in the pathogenesis of preeclampsia. Methods： 100 pregnant women treated in our hospital from March 2014 to May 2015 were selected including 50 normal third trimester pregnant women as control group and 50 preeclampsia patients （gestational age of 38 to 42 weeks） as observation group， i.e. 25 mild preeclampsia pregnant women and 25 severe ones. Immunohistochemical reinforced polymer was used to determine the location of AQP9， reverse transcription—polymerase chain reaction to test the 9 mRNA， protein imprinting technology to test the protein expression levels， and the gel protein quantitative analysis software for determination of protein grey value. Results： Firstly， the AQP9 was located in amniotic epithelial cells， human chorionic trophocyte and sertoli cells. Secondly， expression of AQP9 was found in the membranes and placenta of both groups. Thirdly， the AQP9 grey value on placenta and fetal membrane in the observation group was higher than the control group， with statistically significant difference （P 1资料与方法 1.1临床资料 选取都是我院2014年3月至2015年5月收治的剖宫产患者，纳入标准：（1）所有入选患者经B型超声检查均符合子痫前期的诊断标准[3]；（2）患者签订知情同意书。
排除标准：（1）患有心、脑、肾、肝等严重性疾病患者；（2）患者为过敏体质，对药物过敏；（3）患者患有精神类疾病或正在参加其他临床试验；（4）未按医嘱用药，导致影响最终疗效判断的患者。
患者年龄为21～36岁，平均年龄为（24.53±4.34）岁，孕周为38～42周。
其中50例正常足月妊娠产妇为对照组，25例轻度子痫前期孕妇和25例重度子痫前期产妇为观察组。
两组产妇在年龄、孕周等方面比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
两组患者都没有患上糖尿病、肾炎、肝炎等合并症，而且两组病人也没有出现妊娠期糖尿病、羊水量异常以及胎膜早破等并发症。
对照组患者由于瘢痕子宫、胎位不正等各种因素需要实施剖宫产术，观察组患者除了子痫前期外，没有产生其它并发症，因瘢痕子宫、胎位不正或者病情需要实施剖宫产手术。
1.2方法 1.2.1采集标本对两组患者均实施剖宫产手术，胎盘娩出之后，医师立即在中央无钙化区域取出半径为1.5cm及体积为8cm3的胎盘组织各3份，将取出物置于常温0.9%氯化钠液体中，将血液清洗干净后，将其分成3份，将其中的1份放入标本袋中，并在标本袋中加入10%中性福尔马林，固定1d之后将其送入病理科，经24h石蜡包埋的碳膜组织及胎盘，主要是用作免疫组化研究。
将剩下的2份放入冻存管中，对冻存管进行编号，然后将冻存管放入液氮中进行冷却，最后将其保存在—80℃的低温冰箱中，可在Western—blothing实验和RT—PCR实验中使用[3]。
1.2.2免疫组织化学增强聚合物法用石蜡包埋固定的胎膜组织和胎盘，对其进行切片处理，厚度为3μm，将其进行脱蜡复水处理之后，放入EDTA中，让其进行修复。
在浓度为30%的过氧化氢溶液中添加甲醇，直至将其稀释成浓度为0.9%的溶液，将胎膜组织和胎盘放入稀释后的溶液10min，这样就能将内源性过氧化物酶清除干净；然后将其封闭在5%BSA中，时间维持15min；再向其中加入经稀释液处理过的一抗（稀释比例为1：2000），并且保持4℃的温度，放置1晚；二抗用过氧化物酶进行标记，羊抗兔比例为1∶100，在室温下孵育时长为40min，用二氨基联苯胺对其进行显色，用苏木素复染[4]。
将肝脏细胞当作阳性对照，若细胞膜或细胞质上能清晰地见到棕黄色或者黄色颗粒，则该细胞即为阳性细胞。
1.2.3逆转录—聚合酶链反应利用TRIzol将胎膜组织和胎盘中所有的RNA抽提出来，用分光光度计对260nm和280nm两处位置的吸光度值进行测定，将总RNA的纯度和浓度计算出来，需要注意的是OD260与OD280的比值必须大于1.8，将5lRNA逆转录成cDNA[5]。
1.2.4Western—blothing实验剪碎组织，严格遵照相关文献标准进行，在一抗中应用两组患者胎膜组织和胎盘AQP9多克隆抗体，其比例为1：500，在二抗中采用经过氧化物酶标记处理的羊抗兔IgG，其比例为1：5000[6]。
应用凝胶灰度分析软件Quantitry One4.6.2来检测底片，测量其灰度值，同时对AQP9标本和β—actin的灰度值进行检测，AQP9的相对含量就是AQP9灰度值与β—actin灰度值的比值。
1.3统计学的方法 汇总处理两组患者的临床数据后，应用统计学软件SPSS16.0对其进行处理，其中用χ2来检验组间率对比，用率（%）来表示计数资料；若P>0.05，那么差异不具备统计学意义。
2结果 2.1两组产妇胎膜组织和胎盘中AQP9定位情况 对照组和观察组产妇的胎膜组织及胎盘中都能见到AQP9阳性表达细胞，具体定位于绒毛膜滋养细胞、羊膜上皮细胞以及胎盘合体滋养细胞。
见图1、图2。
2.2两组产妇胎膜组织和胎盘中AQP9mRNA定性表达 在对照组和观察组产妇的胎膜组织和胎盘中都检测到了AQP9 mRNA表达，两组患者的胎膜组织和胎盘标本中都扩增出β—actin，实际扩增片段是77bp，而且都能够测出AQP9 mRNA表达，其中AQP9扩增的片段是78bp，和预期的长度一致。
2.3两组产妇胎膜组织和胎盘AQP9水平 2.3.1两组产妇胎膜组织和胎盘AQP9表达情况AQP9分子量约为27kda，β—actin分子量大约是43kda。
见图3。
图1AQP9在胎膜组织中的表达图2AQP9在胎盘中的表达 图3AQP9在胎膜组织和胎盘中的表达结果2.3.2两组产妇AQP9的灰度值对照组产妇胎膜组织、胎盘中AQP9的灰度值分别为（0.17±0.02）、（0.20±0.02），观察组产妇胎膜组织、胎盘中AQP9的灰度值分别为（0.54±0.16）、（0.54±0.14）。
对比差异具有统计学意义（P。