水通道蛋白4在急性实验性脊髓损伤中的表达

作者：武云涛 李祎 朱庆三 刘景臣。

【摘要】 目的 研究急性实验性脊髓不完全损伤水通道蛋白4(AQP4)的表达规律，探讨脊髓水肿的分子生物学机制。方法 建立兔急性脊髓不完全损伤动物模型，采用免疫组化方法、RTPCR检测脊髓损伤术后6 h、1、3、5和7 d时AQP4蛋白及其mRNA的表达变化。结果 脊髓损伤后AQP4及其mRNA表达即开始增加并持续上升，伤后3 d达到高峰，以后逐渐减少，二者的表达变化呈显著正相关。结论 AQP4参与了脊髓损伤后水肿的形成过程，AQP4过度表达可能是损伤性脊髓水肿的分子生物学机制之一。

【关键词】 水通道蛋白4；免疫组化 RTPCR；脊髓损伤；脊髓水肿。

急性脊髓损伤(acute spinal cord injury，ASCI)临床上常见，常致终生瘫痪，并引起各种并发症甚至死亡。文献报道水通道蛋白(AQP4)与生物体内水分的调节密切相关，在急性脊髓损伤时脊髓水肿的形成和消退中起重要作用〔1，2〕。脊髓水肿是脊髓损伤后的主要并发症之一，而且影响脊髓功能的恢复。本研究旨在探讨急性脊髓损伤后AQP4蛋白及其mRNA的表达变化规律，并对脊髓损伤后AQP4的表达与脊髓水肿的相关性进行分析，进一步探讨损伤性脊髓水肿的分子生物学机制。

1 材料与方法。

1.1 材料。

4～5个月龄健康雄性新西兰大耳白兔48只，体重2.1～3.2 kg，平均2.7 kg。根据脊髓损伤造模成功后6 h、1、3、5、7 d五个时间点随机分成实验1～5组以及对照组，每组平均8只。主要试剂：抗兔AQP4抗体(博士德)；免疫组织化学检测试剂盒及DAB浓缩显色液(迈新)。

1.2 方法。

1.2.1 建立急性不完全性脊髓损伤模型。

3%戊巴比妥钠30 mg/kg静脉麻醉。咬除兔T12棘突和椎板修剪成直径约0.4 cm的圆形骨窗，显露脊髓，在硬膜表面放置与骨窗直径一致的塑料垫片，用自制的改良Allen装置制备脊髓损伤动物模型。实验组参照预试验结果从3 cm高处击打，致伤能量60 gcm。造模成功标志：实验兔双后肢抽动后弛缓瘫。对照组只暴露脊髓节段，不打击脊髓。

1.2.2 脊髓标本的采取。

实验组动物按照分组时间点、对照组动物于术后3d分别处死，以骨窗为中心，切取1.0 cm的脊髓段。将脊髓标本从中心点一分为二，一半于－70℃低温保存，备RTPCR之用；另一半于4%多聚甲醛固定液中固定24 h后用蒸馏水清洗12 h，梯度乙醇脱水、二甲苯透明、石蜡包埋、4 μm连续切片行免疫组织化学染色。

1.2.3 脊髓损伤不同时段AQP4的表达。

切片常规脱蜡，3% H2O2室温浸泡10 min以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗，PBS洗；滴加正常血清封闭20 min，弃血清，直接加一抗，室温下孵育过夜，PBS充分洗；滴加二抗室温下30 min，PBS充分洗；DAB显色镜下控制，自来水充分洗；苏木素染核，脱水透明，封片光镜观察。对照实验：取相同量的正常血清代替AQP4抗体，其余步骤同前。光镜下细胞膜上出现棕黄色颗粒为AQP4免疫阳性细胞。光学显微镜下观察切片，每只兔共染色3张切片，随机选择4处灰白质阳性表达区，用图像分析仪测量脊髓损伤不同时段平均光密度(OD)值，3张切片的均值为该只兔脊髓AQP4表达的OD值。

1.2.4 RTPCR检测脊髓损伤不同时段AQP4mRNA的表达。

不同实验组和对照组脊髓组织各50 mg进行RTPCR分析，按Trizol试剂说明提取组织总RNA；采用MMLV逆转录试剂盒按操作说明逆转录成cDNA；产物进行PCR扩增。参照基因库基因序列设计引物，AQP4引物上游序列5′TTGGACCATCATAGGCGC3′，下游序列5′GCATGTGATCGACATTGACC3′，扩增片段长约214 bp；GAPDH 引物上游引物5′GGGTGATGCTGGTGCTGAGTATGT3′，下游序列5′AAGAATGGGAGTTGCTGTTGAAGTC3′，扩增片段长约700 bp。RTPCR引物由联星公司合成。扩增条件：94℃变性40 s，58℃退火40 s，72℃延伸1 min，反应30个循环后，接72℃延伸10 min。PCR产物进行1%的琼脂糖凝胶电泳，在凝胶成像分析系统中观察并照相。

1.3 统计学处理。

采用SPSS11.0统计软件处理，所有数据均采用x±s表示，采用t检验分析，并分别对脊髓损伤不同时段AQP4染色表达OD值、AQP4 mRNA的表达水平进行Pearson相关分析。