罗格列酮对小鼠Ⅱ型葡萄糖载体mRNA表达的影响

【摘要】 ［目的］ 探讨罗格列酮对小鼠Ⅱ型葡萄糖载体（mGLUT2）mRNA表达的影响［方法］采用分子克隆技术将过氧化物酶体增殖物受体γ(PPARγ)、维甲酸类受体X(RXRα)及mGLUT2 cDNA分别克隆到表达载体pCMX和pGL3b上.PPARγ，RXRα，mGLUT2克隆载体转染NIH 3T3细胞，处理或不处理罗格列酮，应用荧光素酶活性测定法及RNA印迹方法等测定罗格列酮对mGLUT2重组体荧光素酶活性调节及对mRNA表达的影响［结果］罗格列酮可激活mGLUT2重组体荧光素酶的活性，亦可增加mRNA的表达水平［结论］罗格列酮可增强mGLUT2的表达，可能参与PPARγ对mGLUT2的调节过程.

【关键词】 葡萄糖转运蛋白质类 易化性 RNA 信使 罗格列酮。

ABSTRACT:OBJECTIVETo understand the possibility of effect of the Rosiglitazone on mouse glucose transporter Ⅱ(mGLUT2) mRNA expressionMETHODS PPARγ, RXRα and mGLUT2 cDNA clone into pCMX and pGL3b expression vector. The recombinant DNA transfected into NIH 3T3 cells, treated the rosigiltazone and confirm the mGLUT2 activity and mRNA expression by the Rosiglitazone through PPARγ activation with luciferase assay and Northern blotRESULTSThe Rosigiltazone activates the mGLUT2 activity and increase the mGLUT2 mRNA expression through PPARγ activationCONCLUSIONThe Rosigiltazone perhaps binds to PPARγ and regulations mGLUT2 mRNA expression.

Key words:glucose transport proteins, facilitative;RNA messenger;rosigiltazone。

mGLUT2在胰岛及肝脏等组织中表达，而GLUT2在多种病理状态下有较高水平的表达，但其机制不详.罗格列酮是核转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体（PPARγ）的配体，PPARγ和配体结合被激活后，可与维甲酸类受体X(RXRα)形成二聚体，再与PPARs反应元件(PPRE)结合而发挥转录调控作用，PPRE存在于许多编码与糖及脂类代谢相关的蛋白质的DNA上游序列.为探讨罗格列酮是否是通过激活PPARγ参与mGLUT2的表达调节，进而参与组织吸收葡萄糖的过程,达到降低血糖的目的,本实验利用分子克隆技术构建了PPARγ，RXRα，mGLUT2的表达载体系统，将其转染NIH 3T3细胞后处理罗格列酮，通过荧光素酶活性测定和Northern blot等实验方法观察了罗格列酮对mGLUT2活性及对mRNA表达的调节作用.

1 材料和方法。

1.1 材料 NIH 3T3细胞株购自ATCC公司；pCRⅡTOPO载体(Life Technologies, Gaithersburg, MD)，Dulbecco′s modified Eagle′s培养液(DMEM, Life Technologies, Gaithersburg, MD)，LipofectAMINE PLUS试剂 (Life Technologies, Gaithersburg, MD)，OPTIMEN I(Life Technologies, Gaithersburg,MD)，裂解缓冲液(Promega,Madison,WI)、荧光素酶测定试剂 (Promega)及TRIzol○R试剂(Life Technologies, Gaithersburg，MD)均为美国产，层析柱为德国产(Qiagen,Hilden).

1.2 方法。

1.2.1 重组体的构建 mGLUT2启动子的5′侧翼732碱基区间利用2对引物，即上游引物为5′CAT TGC TGG AAG AAG CGT ATC AG3′，下游引物为5′GGA GAC CTT CTG CTC AGT CGA CG3′,内参GAPDH上游引物为5′ACC ACA GTC CAT GCC ATC AC3′，下游引物为5′GGA GAC CTT CTG CTC AGT CGA CG3′，用PCR扩增后将扩增片段插入到pCRⅡTOPO 载体.pCRⅡmGLUT2732用KpnⅠ/BamHⅠ内切酶内切后将片段亚克隆到KpnⅠ/BamHⅠ内切的pGL3b载体上,构建重组体pmGT2.用相同的方法构建重组体pCMXPPARγ(Pg),pCMXRXRα(Ra).利用DNA碱基序列测定法确定重组体序列.

1.2.2 瞬间转染方法及荧光素酶活性测定 利用层析柱对质粒DNA进行提取纯化.细胞培养直至细胞数达到1×106个/孔.细胞经过20h培养吸附过程后，利用LipofectAMINE PLUS试剂进行转染，3h后更换培养液DMEM,同时在实验组培养液中添加罗格列酮（1mg/L），继续培养18h，用裂解缓冲液裂解细胞，经离心沉淀裂解细胞后收集上清液，进行荧光素酶活性测定，蛋白定量测定用Bradford法进行.荧光素酶活性和裂解液的蛋白浓度之比作为荧光素酶相对活性.每个转染实验都进行3组3次实验。