NCLs致病相关基因CLN8真核表达载体的构建及检测
【摘要】 目的 构建真核表达载体,为在哺乳动物细胞内验证NCLs致病相关基因CLN8与ND1是否存在相互作用奠定实验基础。方法 采用PCR 技术扩增CLN8基因, 将其亚克隆到PEF—Flag真核表达载体,在HeLa细胞中表达, 对表达产物进行Western blot鉴定。结果 特异扩增CLN8基因编码序列, 构建了真核表达载体PEF—Flag—CLN8，在HeLa细胞中表达融合蛋白, Western blot实验能够检测到表达的融合蛋白。结论 成功地构建真核表达载体PEF—Flag—CLN8, 融合蛋白在HeLa细胞中有效表达。
Expressing and testing of CLN8P in eukaryocyte。
【Abstract】 Objective To verify the interaction between CLN8 and ND1in mammal cells. Methods The fragment of CLN8 gene was amplified by PCR. The amplified fragment of CLN8 was ligased with the P—Flag vector to construct recombinant plasmid PEF—Flag—CLN8.The recombinant plasmid was transfected into HeLa cell and tested by Western blot. Results The fragments of CLN8 gene was amplified and ligased with PEF—Flag, digested with endonuclease and sequenced,the recombinant plasmid of PEF— Flag— CLN8 was constructed correctly. Experimental result of Western blot suggested that the fusion protein can be expressed in eukaryocyte effectively. Conclusion The recombinant plasmid of PEF—Flag—CLN8 was constructed successfully. The fusion protein can be expressed in HeLa cell effectively.
【Key words】 CLN8P; eukaryocyte expression; tested。
神经元蜡样脂褐质沉积症（the neuronal ceroid lipofuscinoses,NCLs）是一组儿童常见的进行性神经元变性疾病群，多为常染色体隐性遗传。此疾病群的主要临床症状包括快速的视力恶化，癫痫发作，进行性智力障碍，运动失调和行为变化［1］。NCLs主要组织细胞病变特征为溶酶体内脂质沉积，且沉积物中包含的主要蛋白质为线粒体ATP酶亚基C（除NCL1 中SAP A 和D）。目前认为NCLs至少由8种不同的基因发生突变引起（CLN1—8）。分子基因学研究已经鉴定并克隆出此疾病群中与6种类型对应的6个基因（CLN1—3, CLN5—6, CLN8）［2］,其中CLN8 位于常染色体8p,包括3个外显子，编码区全长861bp,分为外显子2和3［3］。本课题组以CLN8基因编码区全长为诱饵,采用酵母双杂交技术,选择在人胎脑cDNA文库中筛选CLN8P相互作用蛋白,已获得一靶基因ND1［4］，其编码产物在酵母体内能够与CLN8P相互作用［5］。为了进一步论证在哺乳动物细胞内CLN8P与ND1是否存在相互作用，本实验构建了PEF—Flag—CLN8真核表达载体, 在HeLa细胞中表达,对表达产物进行Western blot鉴定，为今后NCLs发病机理研究奠定实验基础。
1 材料和方法。
1.1 材料 CLN8基因由NanbertZhong博士惠赠。PEF—Flag真核表达载体及抗FLAG的单克隆抗体、HRP标记的羊抗鼠IgG二抗由上海睿星生物公司提供。Hela细胞购自中科院细胞生物研究所上海细胞库。无支原体新生牛血清购自杭州四季清生物工程公司。DMEM细胞培养基按《组织培养与分子细胞学技术》配制。ECL蛋白印迹法检测试剂盒购自英国Amersham Biosciences. 其他试剂均购自上海生物工程公司和北京鼎国公司。
1.2 方法。
1.2.1 构建真核表达载体P—Flag—CLN8 PCR 扩增CLN8片段, 扩增的产物采用胶回收,以SfiⅠ切下,并回收目的DNA 片段,与同样酶切的PEF—Flag载体连接构建成质粒PEF—Flag—CLN8。重组质粒进行限制性酶切、测序鉴定后,无水乙醇浓缩沉淀,并用紫外分光光度仪定量待转录用。
1.2.2 重组质粒转染Hela细胞 Hela细胞用DMEM培养基接种于六孔板中培养18～24h；分别取PEF—Flag—CLN8质粒2μg/孔及5μl/孔阳离子脂质体用无血清和抗生素的培养基稀释至100μl；将脂质体稀释液滴加到质粒DNA稀释液中，边加边轻轻混匀，室温静置20min；细胞用无血清和抗生素的培养基洗两次，然后加入无血清和抗生素的培养基0.8ml，轻轻晃动使培养基覆盖全部细胞，每孔200μl加入质粒/脂质体复合物溶液，轻晃混匀；细胞37℃、5%CO2培养18h，每孔加入1ml含正常两倍新生牛血清和抗生素的完全培养基以恢复正常的培养，培养18h后，每孔换上标准培养基2～3ml，继续培养16h。
1.2.3 融合蛋白Western blot鉴定 提取细胞总蛋白, SDS—PAGE凝胶电泳,用抗FLAG的单克隆抗体,HRP标记的羊抗鼠IgG二抗进行Western—blot检测转染细胞中表达的Flag—CLN8融合蛋白。