丹参酮ⅡA对肝纤维化大鼠肝组织胶原表达的影响
作者：覃筱燕，严莉，唐丽，戴景峰。
【摘要】 目的探讨丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA，TSN)对肝纤维化大鼠肝组织胶原纤维表达的作用。方法采用四氯化碳(CCl4)诱导大鼠肝纤维化动物模型。将Wistar大鼠随机分为空白对照组，CCl4模型组，阳性对照联苯双酯组(100mg/kg)，TSN高、中、低(21.3，14.2，7.1 mg/kg)剂量组，均以灌胃的方式给药。治疗结束后,动物采血处死，分离血清进行血清总蛋白(TP)和白蛋白(ALb)含量检测，以及肝组织匀浆羟脯氨酸(Hyp)的含量检测，观察TSN对慢性肝纤维化大鼠的肝纤维生化指标的影响;取固定部位肝组织做HE染色和Masson胶原纤维特殊染色病理组织学检查，观察肝组织中胶原纤维表达的情况。结果TSN可以恢复肝纤维化大鼠血清中已降低的TP和ALb含量，并下调肝组织Hyp的含量(P0.05或P0.01); HE染色显示TSN可以明显改善肝纤维化的病理损伤;Masson胶原纤维特殊染色发现TSN可以显著降低肝纤维化大鼠肝组织中的胶原纤维的表达。结论TSN对肝组织中胶原纤维的的合成过程具有显著的抑制作用,从而能阻断肝纤维化的病理过程。
【关键词】 丹参酮ⅡA; 肝纤维化; 胶原纤维; Masson。
Abstract：ObjectiveTo investigate the effect of TanshinoneⅡA(TSN) on the expression of hepatic collagen fibers in rats with liver fibrosis. MethodsHepatic fibrosis was induced by intragastric carbon tetrachloride. The wistar rats were randomly divided into 6 groups：control group, carbon tetrachloride group, bifendate positive control group(100 mg/kg), TSN high, middle, low (21.3,14.2,7.1mg/kg)dose groups. All medicines were given by intragastric administration. Total protein (TP) and albumin (ALb) content in serum were detected in all groups . Hydroxyproline(Hyp) content and histopathology of liver tissue were determined .ResultsTSN could increase the levels of TP, ALb in serum and decreased Hyp level in liver tissue of hepatic fibrosis rats. HE and Masson staining showed that TSN could significantly reduce the expression of collagen fibers of liver tissue in hepatic fibrosis rats. ConclusionTSN can significantly inhibit the synthesis process of collagen fibers in hepatic fibrosis rats, so that it can block the pathological process of liver fibrosis.
Key words： TanshinoneⅡA; Hepatic fibrosis; Collagen fibers; Masson。
已有的研究表明[13],各种原因导致的急、慢性肝损伤进程中由于肝内纤维生成与降解失衡，导致肝脏细胞外基质( ECM)中过多的胶原纤维在肝内沉积而诱发肝纤维化。其病理变化表现为肝内胶原纤维异常增生，肝细胞变性坏死，肝组织结构和功能破坏。丹参为唇形科鼠尾草属植物的干燥根部，为常用中药，有活血祛淤、安神宁心、止痛等功效，其药理及临床应用范围较广。其脂溶性部分有效成分丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA，TSN)已被证明具有抗氧化性、抗急性肝损伤和抗肝纤维化等作用[46]。为了研究TSN对慢性肝纤维化大鼠肝组织胶原表达的作用，本研究采用四氯化碳(CCl4)建立慢性肝纤维化大鼠模型，进一步明确TSN对肝纤维化的治疗作用。
1 材料与仪器。
1.1 动物Wistar大鼠，雄性，180220 g,由中国医学科学院实验动物研究所提供，合格证号：SCXK(京)2005—0013。
1.2 药品与试剂丹参酮ⅡA(TanshinoneⅡA，TSN)：由陕西昂盛生物医药科技有限公司提供，批号20080122，纯度 98%;联苯双酯滴丸(Bifendate，Bif)，北京协和药厂产品，批号07110101。四氯化碳(CCl4)，分析纯，北京化学试剂公司产品，批号:10006492;甲醛溶液，分析纯，北京化学试剂公司产品，于实验前配成10%甲醛溶液备用;花生油，青岛胡姬花牌;水合氯醛，五联化工厂(中国上海)产品，规格250g/瓶;TP、ALb试剂盒，北京华英生物技术研究所产品，批号:080909、080909;羟脯氨酸(Hyp)试剂盒，均为南京建成生物工程研究所产品，批号，080911;HE染液均由中国人民解放军301医院老年医学研究所提供; Masson染液由中国人民解放军205医院病理实验室提供。
1.3 器材7020型全自动生化分析仪(日本Hitachi公司);22R冷冻高速离心机(德国Heraeus公司);CK2—倒置显微镜(日本Olympus公司);sunrise酶标仪(澳大利亚 Tecan公司);ULTRACUT—R 型超薄切片机(德国 Leica 公司生产);EG1150 型石蜡包埋机(德国 Leica 公司);DM—R 型多功能显微镜及测量系统(德国 Leica 公司);高品质显微镜载玻片(海门市世泰实验器材制造有限公司);BH—2型荧光显微镜及摄影系统(日本Olympus公司)。
2 方法。
2.1 动物分组及给药取健康Wistar雄性大鼠60只，体质量160200 g，将大鼠适应性喂养3 d后，随机分为6组，空白对照组，CCl4模型组，Bif组(100 mg/kg)，TSN (21.3，14.2，7.1 mg/kg，即为2.13，1.42，0.71 mg/ml)组，每组各10只。于实验第1周开始各组(除空白对照、模型组外)灌胃(1 ml/100g)给予相应药物，空白对照、模型组给予等量饮用水，1次/d，连续8周。
2.2 动物模型制备及标本采集于实验第3周开始除空白对照组外，各组动物经灌胃给予50%CCl4花生油溶液，首次给予3 ml/kg ，以后改为40%CCl4花生油溶液1 ml/kg ，2次/周，连续6周，共10次。
于实验第8周各组大鼠在7%水合氯醛腹腔注射麻醉后经腹主动脉采血处死，血液经离心(3 000 r/min,10 min)分离血清，进行生化检测;取肝脏，肝左叶中相同部位组织置10%甲醛溶液中固定进行病理形态学观察，余下肝脏组织迅速冻存待检。
2.3 肝纤维化指标 取部分血清采用双缩脲法和溴甲酚绿法按试剂盒方法操作检测血清TP、ALb含量。另取部分肝脏制成10%肝组织均浆，测Hyp含量，采用酶标仪按照试剂盒说明操作测定。
2.4 HE和Masson染色观察 取10%甲醛溶液中固定的肝组织，通过常规脱水、石蜡包埋进行切片，后经HE及Masson胶原纤维特殊染色,光镜下观察肝组织病理改变。
2.5 统计学处理实验数据采用SPSS10.0统计软件进行方差分析及t检验，数据结果均采用±s表示，以P0.05为差异显著，P0.01为差异极显著。
3 结果。
3.1 TSN对肝纤维化大鼠血清中TP、ALb及肝组织中Hyp含量的影响结果显示(见表1)与空白对照组相比,模型组TP、ALb含量明显降低(P0.05，P0.01), 而Hyp含量明显升高; 药物治疗后与模型组相比,各用药组TP、ALb含量均有不同程度升高(P0.05或P0.01), 而Hyp含量明显下降; 高、中剂量TSN组TP、ALb显著高于模型组，而低剂量TSN组只有ALb较模型组升高。提示TSN高、中剂量能明显升高肝纤维化大鼠TP、Alb含量而降低Hyp含量。表1 TSN对肝纤维化大鼠血清中TP、ALb及肝组织中Hyp含量的影响与空白对照组比较，▲P0.05，▲▲P0.01 ;与模型组比较，*P 0.05， **P 0.01;n=10。