盐酸槐定碱注射液对DNA拓扑异构酶活性抑制作用的研究
作者：纪远中， 刘桂敏， 胡人杰， 李德华 论文网。
【关键词】 盐酸槐定碱,；,,,拓扑异构酶；,,活性作用 论文网。
摘要：目的 研究 盐酸槐定碱对 DNA拓扑异构酶I和酶II（TOPO I、II）活性的 影响 。 方法 DNA超螺旋解旋法检测盐酸槐定碱注射液对拓扑异构酶I及酶II介导的 PBR322 DNA解旋反应的影响。结果盐酸槐定碱注射液能明显抑制 TOPO I介导的 DNA 解旋及断裂，在终浓度为6 250 μg/ml 和3 215 μg/ml 时对拓扑异构酶I均有抑制作用，且剂量——效应关系密切，但对拓扑异构酶II介导的 DNA 解旋反应无影响。结论结果提示盐酸槐定碱注射液的直接作用靶点是 DNA拓扑异构酶I，该药为拓扑异构酶I抑制剂。 代写论文。
Abstract：Objective The purpose of this study was to investigate the principle of activity of promoting DNA topoisomerase. MethodsThe effect of Sophoridine hydrochlorium on topoisomerase was measured by supercoiled DNA relaxation assay. ResultsSophoridine hydrochlorium could markedly inhibit the activity of topoisomerase I, by 6250μg/ml and 3215μg/ml respectively, could not prove that it inhibited the activity of topoisomerase II.ConclusionIt may be the fact that DNA topoisomerase I is a direct target in antitumor activity of Sophoridine hydrochlorium. 毕业论文。
Key words：Sophoridine hydrochlorium; DNA topoisomerase; antitumor activity 论文代写。
癌症是严重威胁人类健康的一类疾病，寻找有效的抗癌药物是 目前 世界医学界重要的研究课题，由于合成药物在伴随 治疗 中出现明显的副作用，天然药物越来越受到人们的重视和青睐。盐酸槐定碱是一种植物来源的天然药物，在槐树的果实中含量很高。盐酸槐定碱注射液主治癌症，疗效确切，毒副作用极低。为进一步探讨该药物的作用机理，我们以 DNA拓扑异构酶I、II为靶点，体外测定盐酸槐定碱注射液对其活性的影响，以便为临床治疗肿瘤提供更多的依据。结果报道如下。
1 材料和方法 论文代写。
1.1 材料。
1.1.1 药物盐酸槐定碱注射液由江西中医学院提供。 毕业论文。
1.1.2 试剂PBR322DNA、溴化乙锭（EB）及二甲苯青（FF）均系 Sigma公司产品。DNA拓扑异构酶I试剂盒购自大连保生工程有限公司，DNA拓扑异构酶II系美国 USB产品，琼脂糖系 GIBCO产品，羟基喜树碱购自黄石飞云制药有限公司，鬼臼乙义苷（VP—16）购自江苏恒瑞医药股份有限公司。 毕业论文。
1.2 方法 毕业论文。
1.2.1 拓扑异构酶I活性的测定在20 μl的反应体系中含有10×反应缓冲液（350 mmol/L Tris—HCl pH8.0 mmol/L, 720 mmol/L氯化钾，5 mmol/L氯化镁，50 mmol/L DTT, 50 mmol/L Spermidine）2 μl,0.1% BAS 2μl， PBR322 0.36 μg,阳性对照管（羟基喜树碱）终浓度为212.5 μg/ml，10.6μg/ml。各试管分别加入不同浓度的槐定碱（终浓度分别为6 250，3 215，625 μg/ml）。拓扑异构酶I，各管用蒸馏水补充至20 μl，混匀后置37℃反应30 min，加入5 μl终止液（5%的 SDD,40%的蔗糖，0.25 mg/ml溴酚兰）终止反应。在TBE电泳缓冲液中进行琼脂糖电泳，40 V电压下，电泳4 h。溴化乙啶溶液（1 μg/μl）染色30 min,置260 nm紫外线下观察 DNA的电泳区带，并摄片记录。 论文网。
1.2.2 拓扑异构酶II活性的测定参照 TOPO II试剂盒实验方法,20 μl的反应体系中含有10x反应缓冲液（100 mmol/LTris—HCl, pH7.9 mmol/L, 500 mmol/L氯化钠，500 mmol/L氯化钾，50 mmol/L氯化镁,1 mmol/L EDTA,0.15 mg/mlBSA,10 mmol/L ATP ）2 μl, PBR322DNA0.3 μg,阳性对照管（鬼臼乙义苷 VP—16）5 000，1 000，500 μg/ml。各试管分别加入不同浓度的槐定碱:6 250，3 215，625 μg/ml。储备酶用酶稀释液（10 mmol/L磷酸钠 pH 7.1,50 mmol/L氯化钠，0.2 mmol/L DTT ,0.1 mmol/L EDTA , 0.5 mg/ml BSA, 10%的甘油）稀释至1 μg/ml,加入1 μl。各管用蒸馏水补充至20 μl，在30℃反应15 min，加入3 μl终止液（7 mmol/LEDTA,0.77% SDS,20%甘油，0.25 mg/ml溴酚兰）终止反应。电泳、染色及观察过程同1.2.1。
2 结果 毕业论文。
2.1 盐酸槐定碱注射液对 TOPO I 活性的影响结果见图1。由图1可见阳性对照药羟基喜树碱在2 12.5和10.6 μg/ml 时对 TOPO 酶I均有显著的抑制作用（C,D道）。盐酸槐定碱具有一定的抑制 TOPO酶I的的作用，6 250 μg/ml剂量组对 TOPO酶I有较好的抑制作用,抑制该酶介导的 DNA断裂反应， 3 215 μg/ml剂量组作用稍差，剂量降至625 μg/ml抑制作用不明显，剂量效应关系密切（E,F,G道）。
毕业论文。
2.2 盐酸槐定碱注射液对 TOPO II 活性的影响由图2可见,随着盐酸槐定碱浓度的增加（6 250，3 215，625 μg/ml），超螺旋 DNA均无明显变化，说明盐酸槐定碱注射液对 TOPO II 的活性没有影响（C,D,E道）。阳性对照药VP—16在 5 000，1 000及500 μg/ml（F,G,H道）三个浓度均能显著抑制 TOPO II酶的活性，量效关系明显。 论文网。
3 讨论。
DAN拓扑异构酶是近年发现的维持 DNA复制、重组、转录等信息传递及加工的重要空间构型酶，其催化单链或双链 DNA短暂分离，以利于复制，按其诱导 DNA断裂机制的不同，分为 TOPO I 和 TOPO II 。由于 DNA超螺旋程度影响着机体的活动，而拓扑异构酶的作用正是控制 DNA 的空间构型酶，由此该酶被列为筛选抗肿瘤药物的重要靶酶［1~4］。用 DNA拓扑异构酶I和II介导 DNA断裂实验观察盐酸槐定碱注射液对 DNA作用的方式，这是目前较快速、敏感的体外肿瘤药物筛选方法。 毕业论文。