巢式MSP法检测恶性血液病细胞株p16基因启动子甲基化状态的研究
作者：周华蓉，沈建箴，付海英，叶宝国，范丽萍，林福安。
【摘要】 本研究应用改进的甲基化特异性PCR（MSP）法，即巢式甲基化特异性PCR法检测6种肿瘤细胞株p16基因启动子的甲基化状态效率，探讨其在筛选p16基因启动子高甲基化的肿瘤细胞株，及将其作为研究基因甲基化与表达关系的理想细胞模型中的应用。6种肿瘤细胞株基因组DNA经碱变性后以亚硫酸盐修饰，再用巢式甲基化特异性聚合酶链反应扩增，分析检测其p16启动子区CpG岛的甲基化状态。结果表明： CA46、U266都有不同程度的p16基因启动子区甲基化，而Molt4、 K562、HL—60、Jurkat的p16基因启动子区均未甲基化。结论： 用巢式甲基化特异性PCR可以准确的检测出恶性血液病细胞株p16基因的甲基化状态，方法简单，灵敏且重复性强，可以广泛用于筛选各种p16基因启动子区甲基化的恶性血液病细胞株以及恶性血液病诊断。
Detection of Promoter Methylation of p16 Gene in Hematological Malignant Cell Lines by Nested Methylation Specific Polymerase Chain Reaction。
Abstract This study was aimed to investigate the effeciency of modified methylation—specific polymerase chain reaction i.e.nested methylation—specific polymrase chain reaction，used to detect the promoter methylation of p16 gene in six hematological malignant cell lines，and to explore the application in selection of hematological malignant cell lines with promoter hypermethylation，and make them to be an idel cell models for studying the relationship between gene methylation and expression. DNAs were denatured by NaOH and then were subjected to bisulfite modification and a nested—MSP was used to amplify the promoter region，nested MSP product of p16 gene promoter was analyzed and sequenced.The results showed that the hypermethylation of p16 gene was detected in CA46 and U266，however，Molt4，K562，HL—60 and Jurkat cell lines were unmethylated. In conclusion，p16 gene methylation in hematological malignant cell lines can be perfectly detected by nested—MSP method，which is simple，sensitive and specific for screening all kinds of hematological malignant cell lines with p16 gene methylated.
Key words nested methylation specific polymerase chain reaction; hematological malignant cell line; p16 gene; gene methylation。
目前分析DNA甲基化最常用的方法是甲基化特异性PCR（MSP），在此基础上产生改进的巢式甲基化特异性PCR（nMSP）具有更高的灵敏度和特异性，逐渐被应用于甲基化启动子的分析和检测中，MSP法可以检测出1/1000的甲基化等位基因片段，而nMSP法灵敏度又是MSP法的50倍，因此可以检测出1/50 000的甲基化等位基因片段［1］，适合用于筛选p16基因启动子区甲基化的肿瘤细胞株。本研究主要探索应用巢式MSP检测6种恶性血液病细胞株p16基因启动子区甲基化状态，从而筛选出可以用于甲基化与表达之间关系研究的理想细胞模型。
材料和方法。
材料。
细胞系。
所用7株肿瘤细胞株为本所冻存的细胞株，分别是Molt4、HL—60、K562、Jurkat淋巴瘤、CA46、Hep—G2、U266。
主要试剂。
RPMI 1640培养液购自Gibco公司，胎牛血清为杭州四季青产品，蛋白酶K为Amerco公司产品，Taq酶为TaKaRa公司生产。DNA纯化试剂盒（Wizard DNA Clean—Up System）购自Promega公司。
主要仪器 CO2培养箱（WJ—3D），凝胶成像分析扫描仪（Gel Doc 1000型，BIO—Rad），PCR热循环仪为PE公司产品，型号为2400，UV2100 紫外分光光度仪购自日本Shimadzu公司。
PCR引物。
由上海生物工程公司合成，序列见表1。Table 1.Primers of methylation—specific PCR of p16 gene （略）。
方法。
细胞培养。
7种细胞分别放置在含10％胎牛血清的RPMI 1640培养液中，37℃、5％ CO2、饱和湿度条件下培养，保持实验使用细胞处于对数生长期。
采用酚－氯仿抽提法提取。
基因组DNA的亚硫酸盐修饰 参考Herman等［2］的方法，取1—2 μg DNA，加超纯水至50 μl。加3 mol/L的 NaOH 5.5 μl，37℃放置10分钟。向碱变性的DNA中加入新配制的30 μl 10 mmol/L的氢醌和520 μl 3 mol/L亚硫酸氢钠，以矿物油2滴覆盖液面，50℃放置16到18小时。再用Wizard DNA Clean—Up System 纯化，纯化后的DNA加5.5 μl 3 mol/L的NaOH，室温放置15分钟，最后加33 μl 10 mol/L NH4AC(pH 7.0)，用预冷的乙醇沉淀DNA，并以30 μl超纯水溶解，—20℃储存备用。
巢式甲基化特异性PCR扩增 参考文献报道的方法进行［1］。 第1轮巢式MSP反应扩增1段p16基因启动子区富含CG的序列，片段长度为280 bp，p16F1和p16F2这对引物只识别亚硫酸盐修饰后的模板，而不能区分甲基化和非甲基化的等位基因。将第1轮PCR产物稀释30倍，取2 μl作为第2轮巢式MSP反应的模板，第2轮巢式PCR使用的引物分别是是甲基化（p16M1，p16M2）和非甲基化(p16U1，p16U2)特异性引物，第1轮和第2轮巢式PCR的引物序列见表1。两轮巢式PCR反应的体系均为25 μl，其中10×Buffer（Tris—HCl 100 mmol/L，KCl 500 mmol/L，MgCl2 15 mmol/L） 2.5 μl，dNTP 2.5 mmol/L，各引物300 ng，Taq DNA聚合酶0.6 U，模板DNA 50 ng。PCR扩增在Gene Amp 2400 PCR System 上进行，反应步骤如下： 95℃预变性10分钟，然后95℃变性30秒，60℃退火30秒，72℃延伸30秒，共40个循环，最后，72℃再延伸10分钟。第2轮巢式MSP分别使用非甲基化引物p16U1、p16U2和甲基化引物p16M1、p16M2进行扩增，除引物外反应体系其它部分与第1轮相同，反应条件与第1轮不同的是非甲基化引物退火温度为62℃，甲基化引物退火温度为67℃。同时，以正常人外周血淋巴细胞DNA为阴性对照，水作空白对照，p16基因高度甲基化的Hep—G2作为阳性对照。最后取8 μl PCR产物在2％的琼脂糖凝胶上电泳，在Gel Doc 1000型凝胶图像分析仪上观察并照相。