Amicoumacin B对MG63细胞bmp2转录及蛋白表达作用的研究

作者：杨兆勇 张志斐 贺小波 杨隽 孙薇 丁艳 司书毅 张月琴。

【摘要】 目的 研究amicoumacin B(045195A)对骨形态形成蛋白因子II(BMP2)的作用。方法 采用RTPCR技术，考察amicoumacin B对人骨瘤细胞MG63的BMP2转录的影响；应用流式细胞分析技术研究amicoumacin B对MG63细胞BMP2的表达的影响。结果 Amicoumacin B可在mRNA和蛋白水平增强BMP2的转录及表达。结论 首次证明amicoumacin B有上调BMP2的作用。

【关键词】 诺卡菌； Amicoumacin B； BMP2； 转录； 表达。

ABSTRACT Objective To investigate the effect of amicoumacin B on bone morphogenetic protein2 (BMP2). Methods The effect of amicoumacin B to bmp2 transcription and expression in MG63 cells were studied by means of RTPCR analysis and Flowcytometry respectively. Result Amicoumacin B can enhance the transcription and expression of BMP2 at the level of mRNA and protein. Conclusion The activity of amicoumacin B on BMP2 is proved for the first time.

KEY WORDS Amicoumacin B; BMP2; Transcription; Expression。

骨质疏松症是由于破骨细胞(osteoclast)和成骨细胞(osteoblast)间功能协调失衡，使骨溶解超过骨形成所致。骨形态形成蛋白因子II(bone morphogenetic protein2，BMP2)在成骨细胞分化过程中起非常关键的作用，除了在骨再生和修复过程中促进成骨细胞的分化并抑制其凋亡外［1，2］，还能募集并诱导骨髓干细胞分化为成骨细胞及软骨细胞，通过钙盐沉积形成新骨；此外BMP2能促进成骨细胞标志基因OPN、Cbfa1、Col I alpha1、BSP、ALP和fabp4(脂肪酸偶联蛋白4)等的表达［3～5］，因此在很多研究中， BMP2被视为治疗骨质疏松的重要靶标。

Amicoumacin B是一个由短小芽孢杆菌(Bacillus brevis)产生的寡肽类抗生素［1］，曾报道对胃溃疡有一定的保护作用［2］。本研究在应用以bmp2基因启动子为靶点的新药筛选过程中发现中国医学科学院医药生物技术研究所分离得到的诺卡菌属045195菌株产生的活性成分045195A与amicoumacin B相同，因此本研究首次发现amicoumacin B具有上调BMP2表达的作用。本文报道在mRNA和蛋白水平上评价amicoumacin B活性的研究结果。

1 仪器与试药。

1.1 仪器。

PTC200 DNA扩增仪，SIGMA3K18高速离心机(美国MJ公司)，REVCO 3000 CO2培养箱，DNA SUB CELLTM电泳槽，DYYIII6B稳压稳流电泳仪，CSIM紫外分析仪，Multi Imagetm Light Cabinet Filter Position凝胶成像系统，BD FACSCalibur流式细胞仪。

1.2 材料。

Amicoumacin B由诺卡菌属菌株045195发酵液分离纯化制得，其结构经1H和13C核磁共振光谱确证，纯度高于98%；TRIZOL：Invitrogen公司；RTPCR试剂盒：Invitrogen公司；人骨肉瘤细胞MG63：中国医学科学院医药生物技术研究所保存；山羊抗人BMP2的单克隆抗体：Santa Cruz公司；FITC标记兔抗山羊二抗：北京中杉公司；其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果。

2.1 细胞培养。

人骨肉瘤细胞MG63为贴壁细胞，约48h传代一次。待细胞长满后，弃旧培养基，加适量0.25%胰蛋白酶和0.02% EDTA(1∶1)溶液，在室温下消化约3min，弃消化液，加入含10% FBS的高糖(DMEM)培养基，用吸管反复轻轻吹打瓶皿底壁，使细胞完全脱离瓶皿底壁，分散为单细胞悬液。再按1∶4比例接种该细胞悬液于新的细胞瓶内，补加适量含血清高糖DMEM培养基(不含任何抗生素)，置培养箱继续培养。培养条件：37℃，5% CO2。

2.2 引物的设计。

根据已知的人BMP2的cDNA序列，用Primer Premier 5.0生物软件设计引物，扩增hBMP2的cDNA片段。

hBMP2的扩增引物：

Sense：5′GGTCCTGAGCGAGTTCGA3′。

Antisense：3′ACACTACGCCACCTGACG5′。

GAPDH的扩增引物：

Sense：5′GGGCTCTCCAGAACATCATC3′。

Antisense：3′ACGGGAGTTGCTGGTGAAAC5′。

2.3 RTPCR检测BMP2的转录。

约1×106个MG63细胞贴壁8h，换无血清DMEM，用0、1.0、5.0、10.0、20.0μg/ml amicoumacin B作用12、24及48h，弃培养基，用灭菌PBS洗涤2、3次，用TRIZOL提取总RNA，提取过程按TRIZOL操作指南进行。

按照两步法RTPCR试剂盒使用说明，以总RNA为模板、Oigo dT20为引物逆转录合成cDNA；以cDNA为模板进行PCR。扩增条件为：94℃，5min；94℃，1min；58℃，40s；72℃，50s，共30个循环。