针灸治疗胃溃疡蛋白质组学效应研究平台技术优化与策略研究
作者：杨波，高洋，张燕，严兴科。
【摘要】 目的为开展针灸治疗胃溃疡的蛋白质组研究，建立并优化其蛋白质组分析所需的双向凝胶电泳技术，提高其分辨率及重复性。方法对醋酸型胃溃疡大鼠进行针刺后取其胃部溃疡处组织，对组织蛋白质的提取方法进行改进，优化双向凝胶电泳的关键因素与环节，如样品的制备及预处理，第一向IPG等电聚焦的上样量及电泳参数，第二向垂直平板SDS凝胶浓度、染色方法等。利用PDQuest7.1软件分析获得的二维凝胶图像。结果以固相pH梯度—IPG胶条（pH3～10）进行第一向等电聚焦，以SDS 均一胶（12.5%）的垂直电泳为第二向，成功地得到了两组大鼠胃组织斑点分布均匀、数目较多的双向凝胶电泳图谱。结论通过对蛋白质双向凝胶电泳技术的建立及优化，获得了适合于研究胃溃疡高分辨率、高重复性的双向凝胶电泳图谱。
蛋白质组学是应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门重要学科，采用蛋白质组分析应用和技术可以识别及鉴定一种细胞或组织所表达的全部蛋白质及它们的表达模式，从整体蛋白质水平上在一个更加深入、更贴近生命活动本质的层次上去探讨一些重要的生理、病理现象的本质。典型的蛋白质组研究有两个关键的步骤：①细胞或样品组织中蛋白质的分离。目前最佳的分离方法是多维色谱技术和双向凝胶电泳(two—dimensinnal electrophoresis，2—DE)。②蛋白序列的鉴定。常用质谱仪鉴别出多维色谱和2—DE等分离出的差异蛋白是一已知蛋白，还是一新蛋白［1～3］。2—DE建立于1975年，三十余年的应用和发展使其技术渐于成熟，故在多维色谱出现后，2—DE仍被广泛采用，它是蛋白质组研究的基础，亦是当代研究的关键技术。 胃溃疡是一种世界性的常见病，人群中患病率高达5%～10%，亦有报告推测，每5名男人和10名女人中，可能有一人在他们的一生中患过本病，本病严重地危害了人们的健康［1］。针灸治疗本病取得了较好的疗效，并具有简便、经济、安全、并发症发生率低和不易复发等优势，但目前对于针灸治疗胃溃疡的疗效机制尚不清楚。运用蛋白质组学思维，以2—DE为技术手段研究针刺对醋酸型胃溃疡大鼠胃组织匀浆蛋白的影响，将有助于全面、真实地揭示胃溃疡发生的病理过程以及针刺治疗本病的效应机理。
1 材料与仪器。
1.1 动物。
Wistar大鼠60只（长春高新医学动物实验中心），雄性，清洁级，体质量（200±30）g。
1.2 仪器。
电动玻璃匀浆机、低温超速离心机、电子天平、P20、P100、P1000型精密移液器、MP3 多功能微型垂直板电泳系统(Bio—Rad)、PROTEAN II xi Cell垂直板电泳系统(Bio—Rad)、Power Pac 200和1000电源(Bio—Rad)、GS—800光密度扫描仪(Bio—Rad)、IEF/SDS—PAGE图像分析软件PD Quest 7.3.1(Bio—Rad)、SZ—93型自动双重纯水蒸馏器、TY—B型多用脱色摇床。
1.3 试剂。
17cm IPG3—10预制胶条、尿素、二硫苏糖醇(DTT)、碘乙酰胺(Iodoacetamide)、丙乙酰胺（Acr, A.R.）、N,N甲叉双丙乙酰胺（Bis，A.R.）、40%载体两性电解质(Bio—Lyte 3/10 ampholytes)、矿物油(Minal Oil)以上试剂均来自美国Bio—Rad；两性去垢剂CHAPS、四甲基乙二胺（TEMED, A.R.）、过硫酸胺（APS, A.R.）、十二烷基硫酸钠（SDS, A.R.）以上试剂均来自AMRESCO；低溶点琼脂糖(Agarose, Promega)、三羟甲基氨基甲烷（Tris, A.R., BM）、氨基乙酸（Glycine, A.R., BM）、丙三醇(Glycerin, A.R., 上海化学试剂有限公司)、考马斯亮蓝R—250(CBB, R—250, A.R., 上海化学试剂有限公司)、盐酸(HCl, G.R.,上海)、硝酸银(AgNO3, A.R., 上海) 、无水碳酸钠(Na2CO3, A.R., 上海) 、硫代硫酸钠(Na2S2O3, A.R., 上海化学试剂有限公司)、牛血清白蛋白标准品(BSA, 上海)、苯甲基磺酰氟(PMSF, 上海)。
2 方法。
2.1 设计将60只大鼠随机分为3组：正常对照组、模型组、针刺治疗组。采取乙酸涂抹法造模，术后24 h开始正常喂养，针刺治疗组对足三里、中脘进行毫针针刺，10 d为1个疗程。10 d后取3组胃组织进行观察与研究。
2.2 样品处理胃组织总蛋白的提取：于溃疡模型成功后处死大鼠，分别取出正常对照组与模型组观察溃疡形成情况，取针刺治疗组大鼠胃溃疡处组织进行处理，予冰盐水反复清洗干净，以去除血液， 并尽可能剪去多余的其他组织，滤纸吸去多余的液体，立即置液氮中速冻，后移至—80 ℃低温冰箱保存。将已处理过的标本从—80 ℃冰箱中取出，称取针刺治疗组大鼠胃组织。分别采取传统方法及改良方法，下面仅介绍改良方法，在讨论部分介绍二者区别。剪取约200 mg组织，加入2.0 ml细胞裂解液（8 mol/L的尿素，4%的CHAPS，100 mmol/L的DTT，40 mmol/L的Tris—base和0.5%的两性电解质），在冰水混合物中以1 500 r/min仔细制备匀浆，反复冻融3个循环，加入20 μg/ml DNase I 10 μl和5 μg/ml RNase A 10 μl，在冰浴中1 500 r/min匀浆10 min。转移至离心管，4℃作用15 min后，以15 000 r/min离心30 min，收集上清液即为蛋白质粗提物，—80℃冷冻保存待用。
2.3 样品浓度测定Bradford法［4］。
2.4 双向电泳。
2.4.1 第一向固相pH梯度(IPG)等电聚焦参照Gorg A等［5］的方法略有改动。取上述蛋白质样品，按1 mg的上样量计算出蛋白质上样体积，依该体积加入蛋白质样品，加入样品缓冲液至终体积300 μl，在液体涡旋仪及手掌型离心机上分别混匀。取出—20℃冷冻保存的IPG预制胶条（17 cm pH 3～10），室温中放置10 min。而后，用镊子去除IPG胶条上的保护层。将样本均匀加入胶槽中，胶面向下放入17 cm IPG干胶条，胶条的正极对应于聚焦盘的正极并与电极紧密接触，避免气泡产生，然后滴加覆盖矿物油3ml，需缓慢地一滴一滴将矿物油加在胶条的塑料支撑膜上。对好正、负极，盖上盖子。将聚焦槽水平放入等电聚焦仪中，设置程序。自动程序电泳参数设置见表1。表1 等电聚焦的程序（略）。
2.4.2 平衡等电聚焦后迅速取出IPG 胶条，在桌上先放置干的厚滤纸，聚焦好的胶条胶面朝上放在干的厚滤纸上。将另一份厚滤纸用MilliQ水浸湿，挤去多余水分，然后直接置于胶条上，轻轻吸干胶条上的矿物油及多余样品。将胶条胶面朝上转移至溶涨盘中，每个槽一根胶条，并加入10 ml平衡缓冲液I。将样品水化盘放在水平摇床上平衡15 min。第1次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液I。并用润湿的滤纸吸取多余的平衡液（将胶条竖在滤纸上，以免损失蛋白或损坏凝胶表面）。再加入胶条平衡缓冲液II，将胶条胶面朝上转移至加有平衡缓冲液II的溶涨盘中, 继续在水平摇床上缓慢摇晃15 min。第2次平衡结束后，彻底倒掉或吸掉样品水化盘中的胶条平衡缓冲液II。并用润湿的滤纸吸取多余的平衡液。将IPG胶条从样品水化盘中移出，并完全浸末在1×电泳缓冲液中。
2.4.3 第二向垂直SDS——聚丙烯酰胺凝胶电泳配制12.5％的均匀SDS聚丙烯酰胺凝胶。用滤纸吸去SDS聚丙烯酰胺凝胶上方玻璃板间多余的液体。将低熔点琼脂糖封胶液进行加热溶解(中火1 min左右)。将IPG胶条从1×电泳缓冲液中移出，胶条一端放上低分子量蛋白标记10 μl，然后将胶条胶面朝上放在凝胶的长玻璃板上。用镊子轻轻地将胶条向下推，使之与聚丙烯酰胺凝胶胶面完全接触，避免在胶条下方产生气泡。而后在IPG胶条上注入加热溶解好的低熔点琼脂糖，待低熔点琼脂糖封胶液完全凝固后，将凝胶转移至电泳槽中。电泳参数：初始电压80 V约5 min，以后200 V直至溴酚蓝前沿抵达胶边缘处为止。