利用siRNA抑制HER2表达的研究

【关键词】 siRNA。

The Inhibition of HER2 Expression by siRNA。

Abstract：Objective To inhibit the expression of HER2 gene in MCF7 human breast carcinoma cells by siRNA. Methods Five siRNAs targeting HER2 were designed, and their corresponding expression vectors were constructed and transformed into MCF7 cells. After selection, the stable transfected cells were obtained. The HER2 mRNA abundance in the stable transfected cells was analyzed by RTPCR. The HER2 protein expression in these cells was analyzed by flow cytometry (FCM). The stable transfected cells were transplanted in nude mice, and the HER2 protein expression in transplant tumor was detected with immunohistochemical method. Results siRNA 3P could effectively decrease the HER2 mRNA expression in MCF7 cells. The FCM data showed that the HER2 protein expression in siRNA 2P and 3P transfected MCF7 cells decreased. All the five siRNAs targeting HER2 could decrease the tumorigenesis of MCF7 cells in nude mice. Correspondingly, the HER2 protein expression in transplant tumors was also reduced. Conclusion The siRNAs targeting HER2 mRNA could effectively inhibit HER2 expression in vivo and in vitro, and will be useful for gene therapy of breast cancer.

Key words：HER2; Small interfering RNA (siRNA); Breast cancer。

摘要：目的 利用siRNA抑制人乳腺癌MCF7细胞中HER2基因的表达。方法 针对HER2 mRNA设计了5条siRNA，并构建相应的表达质粒，将质粒转染MCF7乳腺癌细胞，筛选稳定表达株，利用RTPCR分析siRNA对细胞中HER2 mRNA的降解作用；利用流式细胞术分析细胞表面HER2蛋白的表达；利用裸鼠进行体内成瘤性实验，用免疫组化法检测瘤组织中HER2的表达。结果 siRNA 3P能明显降低MCF7细胞中HER2 mRNA的丰度；流式细胞分析表明，其中siRNA 2P 和3P稳定转染的MCF7细胞表面HER2的表达明显降低；五种表达不同siRNA的MCF7细胞在裸鼠体内的成瘤性均有所降低，并且瘤组织中HER2蛋白的表达也明显减少。结论 靶向HER2 mRNA 的siRNA能在体内外有效抑制HER2的表达，可用于乳腺癌的基因治疗。

关键词：HER2；小干涉RNA（siRNA）；乳腺癌。

0 引言 　　HER2在乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、胃癌、肺癌等多种恶性肿瘤中存在基因扩增或过度表达，而在正常人体腔上皮、腺上皮及胚胎中表达水平很低[1]。约30%的乳腺癌患者伴随HER2的过表达[2]，HER2过表达与乳腺癌的发生、发展、转移和不良预后密切相关。 　　RNA干涉（RNA interference, RNAi）是近年发展起来的一种快速、高效、易于操作的使特异靶基因失活的技术。本实验利用RNAi技术，以HER2基因为靶点，设计了5条小干涉RNA（small interfering RNA, siRNA），并从细胞及实验动物水平，观察了siRNA对HER2表达的特异性抑制作用，探讨siRNA作为肿瘤基因治疗的可行性和特异性。

1 材料与方法。

1.1 材料。

1.1.1 细胞株 人乳腺腺癌MCF7细胞株由本室保存，在含10%胎牛血清的RPMI1640培养基、37℃、5%CO2孵箱中培养。

1.1.2 质粒 pSilencerTM 2.1U6 hygro siRNA表达载体购自Ambion公司。

1.1.3 试剂 胎牛血清、RPMI1640培养基为GIBCOBRL产品；限制性内切酶BamHⅠ，HindⅢ，T4连接酶，Taq DNA聚合酶购自TaKaRa公司；质粒提取试剂盒，逆转录酶MMLV购自Promega公司；Trizol试剂，转染试剂Lipofectamine 2000为Invitrogen公司产品；Hygromycin B购自Roche公司；HER2小鼠抗人单克隆抗体购自Sigma公司；FITC标记的羊抗小鼠IgG抗体购自中山公司。

1.1.4 实验动物 4～6周龄雌性BALB/c裸鼠购自中国医学科学院动物研究所。

1.2 方法。

1.2.1 发夹siRNA转录模板的设计 发夹siRNA转录模板的结构如图1所示。siRNA的靶序列长度为19nt，两个反向互补排列的19nt特异性序列由一个9nt的Loop相连接，形成茎环结构。转录模板两端分别为BamHⅠ、HindⅢ酶切位点，并以6个T作为RNA聚合酶Ⅲ的转录终止子。人HER2的mRNA基因序列从GenBank获得，序列号为NM_004448，利用程序siRNA DNA Designer 1.3设计针对HER2的siRNA，从中选择5段19nt的特异性靶序列，分别合成5条发夹siRNA转录模板，见表1。

1.2.2 质粒构建 将合成的5条siRNA转录模板序列退火后，连入线性化载体pSilencerTM 2.1U6 hygro上，先经筛选、酶切鉴定后，再进行测序确定，构建的质粒分别命名为pSilencer1PHER2，pSilencer2PHER2，pSilencer3PHER2，pSilencer5PHER2，pSilencer6PHER2，简称p1P，p2P，p3P，p5P，p6P。对照质粒pSilencer 2.1U6 hygro Negative Control由Ambion公司提供，简称pN。

1.2.3 细胞培养及转染 转染前一天，将对数生长期的MCF7细胞以2×105每孔接种于6孔板中培养，24h后，按照转染试剂Lipofectamine 2000的使用说明书将质粒脂质体复合物（质粒∶脂质体=1∶2）转染细胞，37℃、5%CO2条件下在无血清、无抗生素的培养液中转染5h后换含10%胎牛血清的新鲜培养基，继续培养2天。然后用含有200μg/ml Hygromycin B的选择培养基初步筛选细胞，逐渐增加Hygromycin B的浓度至800μg/ml筛选培养14天，最终获得的单克隆细胞即为稳定转染细胞系。质粒pN转染作为阴性对照，质粒p1P、p2P、p3P、p5P、p6P分别转染得到稳定表达siRNA的细胞株。

1.2.4 pSilencerHER2转染MCF7细胞后HER2表达的检测 采用RTPCR法分析细胞中HER2的mRNA含量：收集稳定转染的细胞，用Trizol试剂提取细胞总RNA，取2μgRNA用MMLV逆转录酶合成cDNA。以cDNA为模板PCR扩增HER2片段，50μl反应体系：cDNA模板0.3μg，0.25mM dNTPs，上下游引物各1μM，Taq DNA聚合酶2u，5μl 10×buffer。30个热循环的参数：94℃ 60s，60℃ 60s，72℃ 90s。同时以GAPDH作对照。HER2扩增引物为：正义，5’CGGGAGATCCCTGACCTGCTGGAA3’；反义，5’CTGCTGGGGTACCAGATACTCCTC3’，扩增产物为300bp。GAPDH扩增引物为：正义，5’CCACCCATGGCAAATTCCATGGCA3’；反义，5’TCTAGACGGCAGGTCAGGTCCACC3’，扩增产物598bp[3]。PCR产物在2%琼脂糖凝胶上电泳，通过自动凝胶成像分析系统，将电泳结果进行扫描分析。 　　采用间接免疫荧光检测HER2蛋白表达的变化：离心收集转染细胞，PBS洗一次后，鼠血清（1∶200稀释）封闭30min，PBS洗一次，以PBS稀释HER2单抗（1∶20），室温孵育30min，细胞经PBS洗一次后，加入FITC标记的羊抗小鼠IgG（1∶50稀释），室温避光孵育30min，PBS洗一次，流式细胞仪检测，488nm激发波长下检测细胞表面HER2的表达。

图1 发夹siRNA的转录模板结构 （略）。

表1 合成的发夹siRNA转录模板序列（略）。

1.2.5 裸鼠皮下移植瘤实验 取稳定转染的细胞2×106个，接种于BALB/c裸鼠背部皮下。在接种后第21天拉颈处死裸鼠，分离出瘤组织，测量瘤的长度(a)、宽度(b)和高度(c)，求出肿瘤近似体积(V)，V=π/6×abc[4]，单位mm3。采用免疫组织化学方法检测肿瘤中HER2蛋白的表达变化。

1.2.6 统计学处理 实验结果采用方差分析和t检验进行统计学分析。

2 结果。

2.1 稳定转染siRNA表达质粒对MCF7细胞HER2表达的影响 　　采用半定量RTPCR法检测转染和未转染MCF7细胞中HER2 mRNA的量。 mRNA的相对量以PCR产物的琼脂糖电泳条带的亮度来判断。实验结果显示，p1P、p2P、p3P、p5P、p6P稳定转染的MCF7细胞中HER2的mRNA表达明显降低，其中p3P稳定转染细胞中HER2 mRNA量最低，干涉效果最明显。转染对照质粒（pN）的MCF7细胞中mRNA的量与未转染的MCF7细胞中mRNA的量一致，见图2。

图2 siRNAs抑制MCF7细胞中HER2的表达（略）。

1: MCF7细胞; 2: 转染pN的MCF7细胞; 3: 转染p1P的MCF7细胞; 4: 转染p2P的MCF7细胞; 5: 转染p3P的MCF7细胞; 6: 转染p5P的MCF7细胞; 7: 转染p6P的MCF7细胞; M: DNA markers 　　采用间接免疫荧光法检测稳定转染的MCF7细胞中HER2蛋白的表达。如果siRNA对HER2的干涉作用强，则细胞表面表达的HER2蛋白也就少，那么细胞表面的荧光强度降低，检测到的峰就会左移。流式检测结果表明，转染p3P、p2P的MCF7细胞检测峰明显左移，HER2表达明显低于对照组，其余组的峰形偏移不明显，见图3。

图3 流式细胞术分析稳定表达siRNA的MCF7细胞表面HER2蛋白的表达（略）。

N: 转染pN的MCF7细胞; 1P: 转染p1P的MCF7细胞; 2P: 转染p2P的MCF7细胞; 3P: 转染p3P的MCF7细胞; 5P: 转染p5P的MCF7细胞; 6P: 转染p6P的MCF7细胞。