兔下颌角截骨后咬肌肌球蛋白重链mRNA表达的变化
［摘要］目的: 通过对兔下颌角弧形截骨后咬肌肌球蛋白重链（MHC）mRNA测定，研究咬肌在骨架缩短后的适应性变化规律。 方法: 3月龄雌性新西兰大白兔25只，行左侧下颌角弧形截骨，右侧不手术作自身对照。2、4、8、12和24周分别处死5只动物，提取咬肌MHCⅠ、MHCⅡ型和内参GAPDH的mRNA进行RT.PCR。 结果: 手术侧较对侧MHCⅠ型的mRNA转录降低，12周后正常。MHCⅡmRNA2周时先降低，4周后恢复正常。2、4、8周MHCⅡ.MHCⅠ手术侧较对侧增加。 结论: 下颌骨架缩短后咬肌发生适应性的改建，咬肌组分的这种变化有利于建立口颌系统新的平衡和咀嚼功能的恢复。
面部形态是软组织及骨组织相互作用和影响的最终产物，这种互动作用在面部轮廓形态中具有重要意义。最富有变化且体现个性特征的是面中、下1.3，下颌骨和咬肌对于面下部形态起着重要作用。按照东方人的审美观，以椭圆形或“瓜子脸”为美，因此，下颌角截骨治疗方腮畸形的措施是目前颅颌面外科常行的美容手术之一。我们用兔模拟临床下颌角截骨，通过对咬肌肌球蛋白重链的两个亚型，即肌球蛋白重链（myo—sin heavy chain，MHC）Ⅰ、Ⅱ型mRNA表达量的测定，研究咬肌的改建能力及功能的恢复特点，为临床下颌骨架改变手术提供一定的理论依据。
1 材料和方法。
1.1 材料。
雌性3月龄新西兰大白兔25只（东南大学医学院实验动物中心提供），体重220～270g。左侧下颌角截骨，为手术侧，右侧为非手术侧，设为对照。以0.6%戊巴比妥钠静脉注射麻醉。于左侧下颌角处作一长2～3cm切口，沿骨面分离咬肌和翼内肌附着部至下颌角前后切迹连线，以前后切迹沟连线作垂线与下颌角形成交点，该交点沿垂线上0.5cm取一定点，以前后切迹点和定点作一条弧线，用磨钻沿弧线打孔定位后截骨。肌肉放置原位，缝合切口。术后3d用抗生素预防感染。分别于术后2、4、8、12和24周处死5只动物，于定点处取部分咬肌，大小0.8cm×0.5cm×0.5cm，迅速放入—70℃冷冻保存。
1.2 RNA的提取与RT.PCR。
（1）总RNA的提取:采用Trizol一步法提取组织的总mRNA。（2）总RNA反转录为cDNA:根据Revertaid TM First Strand cDNA Synthesis Kit说明书，以总mRNA为模板合成相应的互补cDNA。反应体系为20μl，反应条件为70℃变性5min，42℃反转录1h，最后70℃5min灭活反转录酶。（3）PCR:在同一管中扩增MHCⅠ、MHCⅡ及GAPDH mRNA的cDNA产物，反应体系为50μl，反应条件为94℃预变性5min，95℃变性40s，59℃退火1min，72℃延伸2min，共循环29次，最后72℃再延伸10min。（4）本实验所用的PCR引物为MHCⅠ上游5′.GGATCCCTGGAGCAGGAGAA.3′、下游5′.CTTG—CATTGAGGGCATTCAG.3′，大小173bp;MHCⅡ上游5′.CCCTAAAGCGGGAGAATAAG.3′、下游5′.GCTCTG—CATCGACTCTACCAC.3′，大小307bp;GAPDH上游5′.GATCCATTCATTGACCTCCACTA.3′、下游5′.CACCACCT—TCTTGATGTCGTC.3′，大小703bp。
1.3 MHC mRNA转录量分析。
各组分别取8μl PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳。对经EB染色后的目的条带和内参条带进行摄像，应用Imagemaster图像分析仪进行扫描，Total Lab图像分析软件分析图谱，计算目的MHC的相对含量。目的mRNA的相对含量:某mRNA水平相对值=目的条带光密度值.内参GAPDH条带光密度值。
2 结 果。
2.1 PCR产物的凝胶电泳 见图1。PCR产物经凝胶电泳鉴定，扩增片断特图1 不同时间MHCⅠ、MHCⅡ和GAPDH的电泳条带。
2.2 统计结果。
见表1。术后2周左侧咬肌MHCⅠ和MHCⅡ的mRNA表达量较右侧显著下降，4周后MHCⅡ的mRNA左、右侧咬肌无显著性差异。12周后MHCⅠ的mRNA表达量双侧无显著性差异，MHCⅡ.MHCⅠ之值2、4、8周左侧高于右侧，双侧有显著性差异。