安宫牛黄丸对脑外伤大鼠脑内载脂蛋白E合成的调节

作者：徐震 黄李法 戴亚光 王翼伟。

【摘要】 ［目的］探讨安宫牛黄丸治疗脑外伤的机制。［方法］给脑外伤大鼠灌服安宫牛黄丸药粉，采用逆转录—聚合酶链反应（RTPCR）对外伤后大鼠脑组织的载脂蛋白E mRNA进行检测。采用酶联免疫吸附剂测定（ELISA）法测定脑外伤后脑脊液载脂蛋白E的浓度。［结果］安宫牛黄丸能显著增加外伤后脑组织载脂蛋白E mRNA的表达和脑脊液载脂蛋白E的浓度。［结论］安宫牛黄丸可以通过增加脑外伤大鼠脑内载脂蛋白E mRNA的表达和载脂蛋白E的合成，从而促进受损神经系统的修复。

【关键词】 安宫牛黄丸；脑外伤大鼠；载脂蛋白；E mRNA。

Abstract：［Objective］ To explore the effects of angongniuhuang pill on the synthesis of apolipoprotein E in brains of rats after traumatic brain injury.［Methods］ Using reverse transcriptionpolymerase chain reaction（RTPCR） and enzyme linked immunosorbent assay（ELISA），the apolipoprotein E’s mRNA of contused brain tissue and the concentration of apolipoprotein E in CSF at different phases after traumatic brain injury were detected of rats fed with angongniuhuang pills.［Results］High expression of apolipoprotein E mRNA and high concentration of apolipoprotein E were found in rats fed with angongniuhuang pills compared with controls.［Conclusion］Angongniuhuang pills may increase the expression of apolipoprotein E mRNA in brains after traumatic brain injury，thus promote the synthesizing and secreting of apolipoprotein E.

Key words：angongniuhuang pill；rats with traumatic brain injury；apolipoprotein；E mRNA。

安宫牛黄丸具有解热、消炎、镇静、抗惊厥、复苏等［1］多种药理效应，目前仍是临床上常用的确有实效的抢救药。在颅脑损伤患者的救治中取得明显的临床疗效［2］。载脂蛋白E（apoE）是由肝、脾、肾等合成后进入血液循环广泛分布的胆固醇转运蛋白，同时它也是中枢神经系统中主要的载脂蛋白［3］。载脂蛋白E不能通过血脑屏障，中枢神经系统中载脂蛋白E主要由星型胶质细胞合成。近年来研究显示，载脂蛋白E在中枢神经系统损伤的修复中发挥重要作用［45］。本研究旨在探讨安宫牛黄丸对脑外伤后中枢神经系统载脂蛋白E的合成和分泌的影响。

1 资料与方法。

1.1 实验动物与分组。

健康SD大鼠50只，由浙江中医药大学动物中心提供，雌雄各半，随机分为两组，每组25只。I组为安宫牛黄丸治疗组，脑损伤后每只每天予安宫牛黄丸0.21g/2ml灌服，共12d。II组为对照组相应给予等量2ml生理盐水。

1.2 动物模型制作。

采用改进的Feeney法［6］，腹腔注射戊巴比妥钠（30mg/kg）麻醉大鼠，头部消毒，沿正中线切开头皮，矢状缝右侧旁开2mm、冠状缝后两毫米用牙科钻磨开一直径5mm的骨窗。取50g砝码从20cm高处落下，撞击在骨窗内硬膜上，锥体下陷深度3mm。模型制成以后在立体定向仪引导下取得脑组织并行侧脑室穿刺留置静脉留置针针管，作为引流管，用于收集脑脊液，末端封闭后固定于颈项部皮肤。

1.3 脑组织mRNA的表达。

分别在伤后即时、3、7、13d在立体定向仪引导下取挫伤灶周围脑组织100μl，采用半定量逆转录—聚合酶链反应（RTPCR）进行检测。取挫伤脑组织置冻存管，存于液氮中备用。采用T rizol总试剂进行脑组织总RNA提取，然后逆转录合成cDNA第一链，在DNA循环合成仪上进行PCR扩增，质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶电泳。应用凝胶成像分析系统对条带扫描，计算apoE mRNA RTPCR产物条带平均吸光度值，以GAPDH作为内参照，将apoE条带吸光度值与相应GAPDH吸光度值比较，得出apoE mRNA的相对含量。

1.4 脑脊液载脂蛋白E浓度的测定。

分别于伤后30min，3、5、7、9、11、13d从侧脑室留置管中缓慢抽取脑脊液100μl，采用ELISA方法测定脑脊液apoE含量。第一抗体羊抗人apoE抗体（GαE/ E），第二抗体辣根过氧化酶（GαE/ EPO）标记抗体。操作步骤是微孔板加稀释的第一抗体置4℃过夜。用0.05% Tween20冲洗，加0.1%络蛋白置37℃ 1h，用0.05% Tween20冲洗，加稀释脑脊液样本和apoE标准品，置4℃孵育过夜（12～16h），用0.05% tween20冲洗，再加稀释第二抗体和正常羊血清，置37℃孵育2h，加四甲基苯（TMB）置37℃，20min。最后用2.5mol/L硫酸终止反应。比色：405nm波长，在标准曲线对数坐标上，计算出apoE 的浓度。