AdHGF对肺泡Ⅱ型上皮细胞的转染表达及增殖效应

作者：哈小琴，吕同德，赵治华，唐瑜，昌业伟。

【摘要】 目的： 观察AdHGF对肺泡Ⅱ型上皮细胞（ATⅡ细胞）的转染表达及增殖效应. 方法： 以不同转染强度（50，100，200 MOI）AdGFP转染原代培养大鼠ATⅡ细胞，感染后48 h用流式细胞仪检测转染效率. 并以最佳感染强度AdHGF转染ATⅡ细胞，ELISA方法检测转染后48, 72 h上清中HGF的表达水平. 用MTT法检测表达产物对肺泡上皮细胞的效应. 结果： 感染强度为100 MOI时，对ATⅡ细胞的转染效率已达89.61％，以100 MOI的AdHGF转染6×105细胞后48, 72 h上清中HGF的表达分别为(249.4±1.8) ng和(168.0±26.1)ng，且表达产物对ATⅡ细胞有明显的促增殖作用. 结论： AdHGF可有效转染ATⅡ细胞并在细胞中表达，表达产物对该细胞有明显的促增殖作用.

【关键词】 AdHGF；肺泡Ⅱ型上皮细胞；转染；基因表达；细胞增殖。

0引言。

肺泡上皮细胞是覆盖于肺泡表面的一层上皮细胞，分为Ⅰ型和Ⅱ型. 其中肺泡Ⅱ型上皮细胞(alveolar type Ⅱ cell, ATⅡ细胞)具有重要的功能,当受到各种刺激时, ATⅡ细胞可增生并修复已损伤的上皮细胞,起着肺泡上皮干细胞的作用［1］. 肝细胞生长因子（hepatocyte growth factor, HGF）是一多功能生长因子，在生理状态下可促进肺上皮细胞的发生、管腔形成及肺支气管上皮细胞的增生，HGF也可促进急性肺损伤的肺上皮组织增生和修复［2］. 我们在前期构建的携带人HGF基因的重组腺病毒（AdHGF）［3］基础上，观察AdHGF对ATⅡ细胞的转染表达及增殖效应，为AdHGF治疗肺损伤提供依据.

1材料和方法。

1.1材料AdHGF, 携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒（AdGFP）由军事医学科学院二所三室提供，本课题组构建［3］；抗人HGF mAb（RD），重组人HGF蛋白纯品（RD）,DMEM(Gibco),胎牛血清(Gibco)，碱性磷酸酶显色试剂（北京中山生物技术有限公司），MTT(BBI)；Wistar大鼠（甘肃省中医学院，清洁级，180～230 g）.

1.2方法。

1.2.1大鼠ATⅡ细胞原代培养Wistar大鼠腹腔注射肝素（4 U/g）和异戊巴比妥钠（100 mg/100 g）,无菌分离出气管及肺置于生理盐水中，用生理盐水冲洗肺动脉两次后行肺支气管插管，用8～15 mL溶液A(1.3 mmol/L NaCl, 5.2 mmol/L KCl, 10.6 mmol/L Hepes, 2.6 mmol/L Na2HPO4, 10 mmol/L DGlucose, pH 7.4)冲洗2～3次后，用2.5 g/L胰酶冲洗1次，再将胰酶灌满肺（约8～15 mL）,37℃消化20～30 min;剪碎肺组织置入含250 mL/L胎牛血清的溶液B(A液加入1.9 mmol/L CaCl2, 1.29 mmol/L MgSO4)中, 37℃振摇4 min后过100目和200目细胞筛,并用Percoll分离液进行低温（10℃）梯度离心，250 g离心20 min，收集细胞接种于含100 mL/L胎牛血清的DMEM培养液中，37℃ 50 mL/L CO2培养1 h后将未贴细胞转至另一培养瓶继续培养，48 h时对细胞进行碱性磷酸酶染色（改良Gomori氏钙钴法）［4］鉴定.

1.2.2重组腺病毒对原代培养AT Ⅱ细胞的转染将第二代生长旺盛的AT Ⅱ细胞接种至6孔细胞培养板，每孔6×105细胞，次日用不同感染强度（50，100，200 MOI）的AdGFP感染，感染后48 h用流式细胞仪检测转染效率，选择对原代培养ATⅡ细胞的最佳感染强度.

1.2.3腺病毒介导HGF在ATⅡ细胞中的表达将生长旺盛的原代培养ATⅡ细胞接种至6孔细胞培养板，每孔6×105细胞，24 h后用最佳感染强度的AdHGF感染，37℃培养48, 72 h时分别收集上清. 用ELISA检测HGF表达量.

1.2.4HGF表达产物对ATⅡ细胞的作用采用MTT法测定细胞增殖活性. 将原代培养ATⅡ细胞接种于96孔细胞培养板中，每孔细胞数为5×103个. 12 h后吸弃原培养液，每孔加入100 μL 无血清DMEM,HGF表达上清所加的量分别占培养总体积的5%(80 pg)，10%(160 pg), 15%(240 pg),20%(320 pg),25%(400 pg),40%(640 pg)和50%(800 pg). 72 h后每孔加入20 μL MTT, 37℃孵育4 h后，弃上清用DMSO溶解沉淀，测其波长在560 nm 处A值.

2结果。

2.1原代培养大鼠ATⅡ细胞酶消化及贴壁培养法培养大鼠ATⅡ细胞，48 h对细胞进行碱性磷酸酶染色，胞质中可见灰黑以至深黑颗粒状沉淀(图1).

2.2重组腺病毒可有效转染ATⅡ细胞以不同MOI的AdGFP（50, 100, 200 pfu/细胞）感染ATⅡ细胞，随着病毒剂量的加大，其转染率提高（图2）. 当MOI为100 pfu/细胞时，转染率已近90%，表明ATⅡ细胞对重组腺病毒高度敏感；当MOI再加大时，腺病毒对细胞有一定毒性，细胞有少量漂浮现象. ATⅡ细胞感染AdGFP 12 h时，即可在荧光显微镜下观察到大量GFP表达阳性的细胞，随时间的推移，阳性细胞比例继续增多，GFP表达量也升高，48～72 h 时达高峰（图3），此后GFP表达量呈下降趋势，直至第10日时仍可见少量阳性细胞.

2.3重组腺病毒介导人HGF基因在肺泡上皮细胞中的表达用ELISA方法检测AdHGF感染肺泡上皮细胞后HGF的表达，结果感染后48 h表达量约为(249.4±1.8) ng/6×105细胞；至72 h时仍有较高的表达［（168.0±26.1）ng/6×105细胞］. 这说明腺病毒介导的人HGF基因可在肺泡上皮细胞中高效表达.