杭州甲型副伤寒分离菌株脉冲场凝胶电泳分型

【摘要】 目的 研究杭州部分地区甲型副伤寒暴发与散发分离菌株的分子流行病学关系及菌株耐药状况。方法 对2002～2005年杭州地区L县和X区5起暴发疫情和10起散发病例的分离菌株，采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)分型方法进行分子分型，采用纸片法（K－B法）测定2种分离株的抗生素敏感性。结果 分离自2个地区的15株菌株被分为A、B、C、D共4 型，A、B、C等3个型密切近缘，同属一个克隆系。L县2005年7月和8月2起暴发菌株和8月3株散发菌株的PFGE型别均属B型，X区2004年12月和2005年9月的2起暴发菌株和9，10月的6株散发菌株的PFGE型别同属C型。4个型别的菌株对复方磺胺甲唑和利福平均100%耐药, 对头孢唑啉、头孢曲松、链霉素、庆大霉素、阿米卡星、氯霉素、诺氟沙星、环丙沙星、呋喃唑酮均敏感, 对氨苄西林、多西环素和四环素等不同程度耐药。结论 除1株散发菌株外，2002～2005年分离自杭州L县和X区的甲型副伤寒病原菌属于同一克隆系。散发病例可能均属于暴发流行后的散发流行。

【关键词】 甲型副伤寒沙门菌。

脉冲场凝胶电泳(pulse field gel electrophoresis, PFGE)分型为一种重复性好、分辨率高的细菌分子分型方法，被广泛应用于细菌感染的分子流行病学研究。近年来，杭州地区发生多起甲型副伤寒暴发疫情，部分地区反复多次发生，已成为严重的公共卫生问题。本文应用PFGE分型技术分析了2002～2005年杭州地区5起暴发疫情和10起散发病例的分子流行病学特征，并进行抗生素敏感性观察。现将结果报告如下。

1 对象与方法。

11 菌株来源与鉴定 收集2002～2005年杭州市L县和X区甲型副伤寒患者血培养及粪便中分离的甲型副伤寒沙门菌171株，其中分离自L县3起暴发疫情103株，散发病例3株；分离自X区2起暴发疫情58株，散发病例7株。菌株均由杭州市疾病预防控制中心微生物检验科依据GB 16001—1995进行鉴定。鉴定试剂：肠杆菌科鉴定试条ATB ID32E(法国生物梅里埃公司)；沙门菌诊断血清（成都生物制品所、兰州生物制品所），均在有效期内使用。

12 方法。

121 仪器与试剂 (1)主要仪器：CHEF DRII 脉冲场电泳仪、BioRad凝胶图像分析系统、BioRad紫外分析仪(美国BioRad公司)。(2)主要试剂：蛋白酶K（上海Sangon公司）；XbaI(日本TaKaRa公司)；Seakem Gold琼脂糖(美国Cambrex公司)、05×TBE(自行配制)；Marker沙门菌Braenderup血清型H9812株（中国疾病预防控制中心惠赠）。

122 药物敏感性试验 选择14种抗生素，采用WHO推荐的改良Kirby—Bauer纸片法进行药物敏感试验。14种抗生素药敏纸片、Mueller—Hinton琼脂(杭州微生物试剂厂)，均在有效期内使用。结果判定参照卫生部制定的《纸片法抗菌药物敏感试验标准》（WS/T 125—1999）。质控菌株为大肠埃希菌ATCC25922、铜绿假单胞菌ATCC27853、金黄色葡萄球菌ATCC25923，均为本实验室保存。

123 PFGE分型 从每起暴发疫情分离菌株中各选择1株以及散发病例分离株作为代表菌株，计15株；操作方法按照美国疾病预防控制中心PFGE标准方法〔1〕并略加改进：Luria—Bertani（LB）平板划菌37℃过夜,无纤维棉签沾取细菌到25ml细菌悬浮液A600比浊，吸光度12～14之间。于400μl菌液加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)，再与等体积的预熔1%Seakem Gold琼脂糖:1%十二烷基磺酸钠(SDS)溶液混匀后，制备琼脂块。用50μg/ml蛋白酶K液消化2h。分别用15ml双蒸水和TE洗2和4次，消化和洗涤均在54℃摇床170r/min中进行。然后切胶至15ml PE管中，于37℃水浴中以25U XbaI酶切2h。将胶条包埋于1%Seakem Gold琼脂糖〔05×Tris—硼酸(TBE)缓冲液〕。CHEFOⅡ电泳仪电泳19h,脉冲电泳起始转换时间为22s、最后转换时间为638s、电压为6V/cm、角度120°，电泳液为05×TBE缓冲液，电流控制在140mA左右，电泳缓冲液温度保持在14℃。溴化乙锭染色，凝胶图像分析系统保存结果。分型判别标准：按文献判别标准〔2〕, 酶切后图谱完全一致,判定为同一型；酶切后图谱有1～3条条带不同者，判定为菌株间关系较密切；酶切后图谱如有3条以上条带不同者，则判定为菌株间关系不密切。同时采用Dice相似性系数评估PFGE图谱间的相似性〔3〕，应用Quantity one软件计算电泳条带分子量。