乙肝多表位抗原基因非融合表达载体的构建和表达

【摘要】 目的: 研究乙型肝炎病毒（HBV）多表位基因的在原核载体中的克隆、 游离表达及其产物的抗原性。方法: 设计、 并合成HBV多表位抗原基因BPT, 克隆入原核表达载体pBAD/gIIIA, 进而转化Top10大肠杆菌, 阿拉伯糖诱导表达出HBV多表位抗原蛋白（BBPT）, 并用Western blot方法初步检测该抗原蛋白的抗原性。结果: 成功构建了原核表达载体pBAD/BPT, 在大肠杆菌中表达出HBV多表位抗原蛋白BBPT, Western blot 检测显示该蛋白具有良好抗原性。结论: HBV多表位抗原基因的设计是成功的, 其在大肠杆菌中表达的非融合蛋白具有良好的抗原性, 可能是较理想的HBV治疗性疫苗候选物。

【关键词】 乙型肝炎病毒 多表位 治疗性疫苗。

乙肝是严重危害人类健康的疾病之一, 但目前的乙肝治疗药物如IFNα和拉米夫定（lamivudine）疗效都不很理想。治疗性疫苗作为一种新的治疗途经, 是乙肝治疗的理想方向之一。我们基于HBV表位的现有资料及前期工作, 从HBV基因组中筛选出5个高度保守的HLA识别表位肽, 串连拼接成乙型肝炎多表位抗原基因, 并在大肠杆菌中得到克隆表达。

1 材料和方法。

1.1 材料 质粒pBAD/gIIIA及大肠杆菌BL21、 Top10由南方医科大学分子生物学院保存。T4连接酶购自Promega公司, IPTG及T载体购自天象人生物工程公司, DNA标志物及限制性内切酶EcoR I、 BamH I购自华美生物工程公司, HRP标记的羊抗鼠IgG购自武汉博士德生物工程公司。复合多表位抗原基因片段的选择见文献［1］。引物合成由上海生工生物工程公司合成, 浓度2OD/管, 工作浓度6 μmol/L。

1.2 方法。

1.2.1 HBV复合多价抗原基因的设计与合成 参照文献［1］。

1.2.2 基因的克隆及阳性重组子的筛选 根据pMD18T载体和pBAD载体的结构特征, 设计两端带有Nco I和EcoR I酶切位点的引物: 5′GCCCATGGCAATGCAGTG GAACTCC3′（上游引入Nco I酶切位点）; 5′GCGAAT TCCACCCAGACGAGCTAC3′（下游引入EcoR I酶切位点）。以CAG176为模板［1］, PCR扩增出乙型肝炎预防治疗性疫苗基因BPT(扩增条件: 94℃变性5 min, 94℃ 1 min, 55℃ 50 s, 72℃ 55 s, 扩增30个循环, 最后72℃延长10 min)。PCR扩增产物以冻融法割胶回收, 与T载体15℃连接过夜后转入大肠杆菌DH5α, 涂板培养, 挑取单菌落培养, 抽提质粒T/BPT, 以Nco I和EcoR I酶切T/BPT及载体pBAD, 冻融法回收小片段和大片段, 两者15℃连接过夜, 转化入大肠杆菌Top10, 涂板培养。挑取单菌落抽提质粒, 以Nco I和EcoR I双酶切, 并以该质粒为模板, 上述引物和PCR扩增条件进行扩增, 酶切产物及扩增产物均以10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定, 以筛选出阳性重组子。

1.2.3 BPT原核表达载体的构建和表达 筛选出的阳性重组克隆转化入大肠杆菌Top10, 涂板培养, 挑取单菌落在LB培养基中培养过夜后, 按1％接种量接种到2 mL LB培养基中, 培养4 h后加200 G/L的阿拉伯糖至质量终浓度为0.2 g/L诱导表达, 3 h后收菌, 取菌液0.5 mL, 离心后去上清, 沉淀中加入100 μL pH=8.0的TE和100 μL 2×SDS蛋白上样缓冲液, 混匀后沸水中煮10 min, 取20 μL 上样, 行150 g/L SDSPAGE蛋白电泳。

1.2.4 蛋白的纯化 使用SPSepharose阳离子柱层析纯化HiTrap , SPSepharose HP 5 mL 预装柱经20 mmol/L、 pH9.0的Tris.CL缓冲平衡液, 将透析液上SP柱, 用20 mmol/L、 缓冲液及含1 mol/L NaCl的 TrisHCl缓冲液（ pH9.0）进行梯度洗脱并分步收集洗脱峰。

1.2.5 Western blot检测融合蛋白与HBV患者血清反应的免疫特异性 Western blot方法参照《分子克隆实验指南》第2版进行, 一抗为BPT基因在原核融合表达蛋白P/BPT的小鼠免疫血清［2］, 1∶20稀释。二抗为辣根过氧化物酶HRP标记的羊抗鼠IgG, 1∶300稀释, DAB显色。

2 结果。

2.1 pBAD/ BPT重组表达质粒的构建 以CAG176为摸板, 按材料和方法所示引物及扩增条件行PCR扩增出BPT基因。扩增产物的20 g/L琼脂糖凝胶电泳在400 bp处可见扩增条带, 如上述方法所述, 该基因克隆入表达载体Pbad, 行PCR鉴定可扩增出400 bp片段（图1）, Nco I和EcoR I双酶切该质粒可切出400 bp片段（图2）, 与设计完全相符, 成功构建了重组质粒pBAD/BPT。

图1 重组质粒pBAD/BPT的PCR扩增图（略）。

Fig 1 The PCR amplification of recombinant pBAD/BPT。

1, 2: The PCR amplification of different recombinant plasmids; 3: 100 bp DNA ladder.

图2 重组质粒pBAD/BPT双酶切鉴定图谱（略）。

Fig 2 Enzymatic analysis of pBAD/BPT。

1: Recombinant pBAD/BPT digested with Nco I/EcoR I; 2: Vector pBAD digested with Nco I/EcoR I; 3: 100 bp DNA ladder.

2.2 重组质粒在大肠杆菌中的表达 重组质粒pBAD/BPT转入大肠杆菌Top10, 挑取单菌落阿拉伯糖诱导表达, 行SDSPAGE电泳, 在Mr 15 000处见一表达带, 符合设计分子量, 空菌及空载对照皆无表达（图3）。

图3 SDSPAGE(150 g/L)电泳分析BBPT蛋白（略）。

Fig 3 SDSPAGE(150 g/L) of BBPT expressed in E.coli。

1: Lysate of BL21 without plasmid; 2: Lysate of pBAD/BL21; 3—5: Expression of BBPT protein in different recombinant transformants; 6: Low molecular weight protein marker.

2.3 表达产物的纯化 SPSepharose为强、 阳离子型交换树脂, 其树脂基为X连接琼脂, 吸附容量3～120 g/L, 是较为理想的交换树脂。利用该层析柱透析平衡后上样, 于1 mol/L NaCl阶段洗脱得到乙型肝炎多表位抗原蛋白, SDSPAGE分析显示, 在Mr约15 000处有一单一的蛋白条带, 纯度可达90%。获得较纯重组蛋白, 命名为BBPT（图4）。

图4 BBPT表达蛋白纯化图（略）。

Fig 4 Purification of BBPT protein。

1, 2: The second elution of supernatant; 3: Low molecular weight protein marker; 4, 5: The first elution of supernatant; 6, 7: Purified BBPT protein.

2.4 Western blot结果 BPT基因在原核融合表达蛋白P/BPT 的小鼠免疫血清可特异识别B/BPT蛋白, 而不可识别空载体pBAD表达蛋白（图5）, 提示该重组蛋白具有较理想的免疫原性。

3 讨论 　　乙型肝炎是严重危害人类健康的病毒性传染病。但是, 以干扰素和核苷类似物为主的抗病毒药物治疗, 效果不尽人意。免疫耐受是造成慢性乙肝病毒携带者呈持续病毒感染状态的主要原因之一, 也是现有的抗病毒药物对慢性乙肝病毒携带者疗效不佳的主要原因。治疗性疫苗属于特异性主动免疫疗法, 国内外的研究初步证明, 治疗性疫苗可以打破慢性乙肝病毒感染患者最主要的免疫学反应紊乱, 即对乙肝病毒及其抗原不产生免疫应答免疫耐受状态［3］。

图5 BBPT蛋白的SDSPAGE及Western blot结果（略）。

Fig 5 Analysis of production of BPT in E.coli by SDSPAGE and Western blot。

1, 3: SDS PAGE of purified BBPT protein; 2: SDS PAGE of control vector without exogenous gene; 4: Low molecular weight protein marker; 5, 7: Western blot of purified BBPT protein; 6: Western blot of control vector without exogenous gene.

我们在多年表位疫苗研究的基础上, 设计了预期同时具有预防和治疗作用的HBV多表位疫苗基因, 并在大肠杆菌BL21中表达和纯化出含外源蛋白和β半乳糖酐酶部分氨基酸的融和蛋白PBPT（Mr 75 000）［1］, 但是融合蛋白在实际应用中存在着一定的缺陷, 所以我们尝试在游离表达载体中pBAD中表达并纯化该基因序列的蛋白产物BBPT, Western blot结果显示BBPT具有较理想的抗原性, BPT基因在原核融合表达蛋白P/BPT的小鼠免疫血清可特异识别B/BPT蛋白, 而不可识别空载体pBAD表达蛋白, 提示该重组蛋白具有较理想的免疫原性, 为该多表位疫苗应用于临床实践奠定了初步基础。 　　从发展趋势来看, 乙肝病毒治疗性疫苗将成为本世纪对慢性乙肝病毒感染特别是慢性乙肝病毒携带者治疗研究领域的热点, 它与现有抗乙肝病毒药物的联合应用, 将成为一种新的治疗方法。DNA疫苗因其与宿主整合的危险性而受到应用限制, 多肽疫苗虽已在实验研究中表现出理想的效果［4, 5］, 但是多肽合成价格昂贵且无法再生。我们设计的HBV复合多表位疫苗基因, 从理论上讲更符合机体抗HBV免疫机制, 并在大肠杆菌中表达和纯化出具有特异性抗原活性的重组融合及游离蛋白, 为HBV多表位治疗性疫苗的研究奠定了初步基础。

【参考文献】 　　［1］ 骆利敏, 李 明, 夏 虎, 等. 乙型肝炎病毒多表位疫苗基因的设计、 合成及表达［J］. 中华微生物学和免疫学杂志, 2004,24(6): 426 —431.　　［2］ 骆利敏, 李 明, 夏 虎, 等. 乙型肝炎病毒多表位抗原DNA疫苗的免疫原性研究［J］. 细胞与分子免疫学杂志, 2004, 20(5): 517—520.　　［3］ Cohen J. Vaccine get a new twist［J］. Science, 1994, 264: 503—505.　　［4］ Vitiello A, Ishioka G, Howard M, et al. Development of a lipopepetidebased therapeutic vaccine to treat chronic HBV infection［J］. J Clin Invest, 1995, 95: 341—349.　　［5］ Brian D, Livingston, Crimi C, et al. The hepatitis B virusspecific CTL responses induced in human by lipopeptide vaccination are comparable to those elicited by acute viral infection［J］. J Immunology, 1997, 159: 1383—1392.