HBeAg阴性血清中乙肝病毒前C区变异分析
作者：郭龙华，黄宪章，庄俊华。
【摘要】 目的 了解本地区乙型肝炎病毒（HBV）流行株前C（PreC）基因的变异，为临床提供诊疗信息。方法 通过设计2条特异性引物进行PCR扩增病人血清中PreC基因序列，回收PCR产物直接进行DNA测序和比对分析。结果 PreC变异主要集中在nt 1896位G→A。结论 PreC变异可使HBeAg阴转。
A study on the mutations of precore gene of hepatitis B virus genome in e antigen—negative sera。
【Abstract】 Objective To investigate the mutations of precore gene in the e antigen—negative sera of patients with hepatitis B virus（HBV） infection and provide information for diagnosis and remedy of the diseases.Methods Precore gene were amplified by heminested—PCR from e antigen— negative sera and e antigen —postive sera，and the PCR products were sequenced，and the sequences were analysed.Results There was a hot point mutation in nucleotide position 1896G→A in precore gene.Conclusion The mutations in precore gene an cause e antigen sero conversion.
【Key words】 hepatitis B virus;mutation;precore gene。
乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是不完全双链环状DNA病毒，基因组全长约3.2kb，为目前已知对人类致病的最小DNA病毒。HBV复制过程中要经过逆转录，由于逆转录酶缺乏有效的碱基校对功能，故HBV基因组比一般DNA病毒易发生变异。这给疾病的预防、诊断、治疗和预后带来新的问题。有关HBV基因组的变异，近些年来一直是人们研究的热点。
过去认为乙肝病毒e抗原（HBeAg）阴转，表明病情向好的方面发展。研究证明，如果体内还有HBV在复制，HBeAg阴转往往是HBV在体内发生变异的结果，易使疾病慢性化。HBV PreC基因定位于乙肝病毒基因组nt1814—1900，PreC由于突变，提前出现终止子，HBeAg合成提前终止，影响干扰素疗效［1］。PreC是高变区，研究PreC的变异具有重要的临床意义。
1 材料与方法。
1.1 材料。
1.1.1 血清标本。
来源于我院门诊和住院病人。
1.1.2 主要仪器。
Roche公司Light Cycler型荧光定量PCR仪、飞鸽牌TGL—16B台式高速离心机。
1.1.3 主要试剂。
广州达安基因公司HBV DNA荧光PCR定量检测试剂盒、蛋白酶K（Merck公司）、平衡酚（国产），裂解液（自配）。Taq DNA酶（MBI公司）、dNTP（Promega公司）、PCR产物直接回收试剂盒和DNA Marker（北京天为时代公司）。
1.1.4 引物。
参照GenBank中的HBV基因组序列，用Primer Premier 5.0软件设计2条特异性引物（半巢式PCR）：正义引物P1:5′—GAC TCT CAG CAA TGT CAA CG—3′（nt 1669—1688）；反义引物P2:5′—TCA TCA ACT CAC CCC AAC AC—3′（nt 2099—2080）；由北京三博远志生物公司合成。设计PCR终产物431bp。
1.2 方法。
1.2.1 标本采集。
收集30例HBeAg阴性标本（HBV DNA含量3.0×103~3.1×105copies/ml）和5例HBeAg阳性标本（HBV DNA含量都高于5×105copies/ml，用于对照）。
1.2.2 HBV DNA的提取。
方法参照文献［2］。
1.2.3 PCR扩增。
10×缓冲液5μl，P1、P2（5μmol/L）各2μl，dNTP（10mmol/L）1μl，Taq DNA酶（1U/μl）1μl，MgCl2（25 mmol/L）3μl，模板6μl，ddH2O 30μl。加石蜡油30μl，94℃ 5min。然后94℃ 1min，53℃ 1min，72℃ 1min共循环35次，72℃延伸5min。