N乙酰半胱氨酸对急性肺损伤大鼠环氧合酶2的影响

【摘要】 目的： 探讨N乙酰半胱氨酸(NAC)对急性肺损伤(ALI) 大鼠环氧合酶2 (COX2)的影响,进一步研究N乙酰半胱氨酸对急性肺损伤(ALI)肺组织的保护作用。方法： 应用脂多糖(LPS)诱导大鼠急性肺损伤(ALI)模型,然后应用N乙酰半胱氨酸进行干预。实验设对照组、模型组、N乙酰半胱氨酸组，在肺损伤模型成功后24 h处死大鼠,取左叶肺组织。采用免疫组化染色, 检测N乙酰半胱氨酸对急性肺损伤大鼠肺组织中COX2的表达, 利用HPIAS2000图像分析系统测定COX2在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果：实验对照组肺组织中COX2的表达较低；模型组肺组织中COX2的表达高；N乙酰半胱氨酸组肺组织中COX2表达较低。经q 检验，实验对照组与模型组之间，COX2的平均光密度及阳性面积率有显著性差异(P＜0.01﹚，实验对照组与N乙酰半胱氨酸组之间，COX2的平均光密度及阳性面积率差异无显著性(P＞0.05)。结论： N乙酰半胱氨酸可以减轻肺损伤的程度，对急性肺损伤组织具有重要的保护作用。

【关键词】 N乙酰半胱氨酸 肺损伤 环氧合酶2 (COX2)。

急性肺损伤(acute lung injury, ALI)是一种肺部过度炎症反应,以肺泡毛细血管膜损伤、通透性增加、肺水肿,炎性细胞浸润和严重气体交换障碍为主要特征［1］。N乙酰半胱氨酸(NAC)是左旋精氨酸的天然衍生物,是一种含活性巯基化合物［2］。近年国内外大量实验研究结果已经证明,具有强大的抗氧化和细胞保护作用。 　　但有关NAC对急性肺损伤炎性细胞因子影响的研究尚少。我们应用脂多糖(LPS)诱导大鼠急性肺损伤(ALI)模型,然后应用NAC进行干预，观察急性肺损伤大鼠肺组织中COX2的表达，进一步探讨NAC在防治急性肺损伤中的作用机制。

1 材料和方法。

1.1 动物模型制备及分组。

健康Wistar大鼠60只（雌雄不拘）, 清洁级（SPF），平均体重(180±35)g，由武汉大学实验动物中心提供。试验前禁食12h, 自由饮水。实验分组分为3组：实验设对照组（注射等量生理盐水，n=20）、模型组（经颈外静脉缓慢注射LPS 2.5 mg/kg，n=20)、NAC组（于尾静脉注射LPS前1 h分别经腹腔注射NAC(200 mg/kg)，n=20）。称重后, 7%水合氯醛5ml/kg 腹腔注射麻醉, 仰卧固定, 模型组消毒后经颈外静脉缓慢注射LPS 2.5 mg/kg。

1.2 动物标本制备。

将各组动物处死，收集肺组织标本，进行组织学及免疫组织化学标本制作。取材时间为LPS注射后24h(T24)。

2 主要试剂 浓缩型兔抗鼠COX2多克隆抗体(武汉博士德生物技术公司)；超敏即用型SP通用型免疫组织化学试剂盒（福州迈新生物有限公司）；显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）。

2.1 主要仪器。

YWY781型医用微波仪（250 W，50 Hz），浙江临安电子器材厂生产；家用高压锅。

3 方法。

3.1 常规HE染色。

取材、固定、脱水、透明、切片和HE染色。

3.2 免疫组织化学SP法检测COX2相关抗原 主要步骤：

① 组织切片5μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；。

② 3%过氧化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min；。

③ COX2采用微波抗原修复（3档，10 min），采用高压抗原修复PBS洗4×5min；。

④ 正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应；。

⑤ 一抗37℃孵育1 h，PBS洗4×5min；。

⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；。

⑦ 链霉菌抗生物素蛋白过氧化物酶复合物37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；。

⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应；。

⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。

用PBS代替一抗作为阴性对照。