胰腺组织单细胞悬液制备方法的比较研究
作者：张召辉 李 玺 夏安周 路逵阳 陈复兴。
【关键词】 胰腺。
摘 要：目的：寻找更好的胰腺组织单细胞悬液制备方法。方法：以大鼠冷缺血胰腺组织作为标本，分别采用剪碎和研磨法制备胰腺组织悬液。经台盼蓝染色测细胞存活率，并进行流式细胞术分析。结果：剪碎法细胞形态较完整、存活率高；两种方法细胞凋亡水平（APO）、CV值有显著性差异（P 0.01）。结论：胰腺组织单细胞悬液制备剪碎法优于研磨法。
Comparative Study of two Methods for Making Pancreatic Tissue into Single Cell Suspension。
Abstract：Objective： To explore the mechanical methods for making pancreatic tissue into single cell suspension. Method： All of the samples for this experiment were collected from pancreas of rat with post cold ischemic injury . Single cell suspension got by “cut” and “homogenator” way were detected with FCM（Flow cytometry）. The cell viability was assessed by typan blue exclusion；The morphologic changes of cell were observed. Result： Cells got by the method of “cut” were intact，the viability was good，the percentage of APO and CV vales were low. Conclusion： The method of“cut”with sissors for making renal tissue into single cell suspension was better than that of“homogenator”.
Key words： Single cell suspension； Pancreas； Flow cytometry。
流式细胞术（Flow cytometry ，FCM）是近年来发展起来的一种细胞的分析新技术，具有快速、精确、高灵敏、多参数等特点［1］。在这项技术中，细胞的分析检测均以单个细胞为基础，因此单细胞悬液样品的制备是关键的环节，细胞数量不足、细胞粘连成块、样品中杂质碎片过多均可造成分析失败，而实体组织的单细胞悬液制备尤为困难。本实验采用剪碎法和研磨法制备新鲜胰腺实体组织单细胞悬液，旨在通过胰腺细胞活力测定，流式细胞术分析比较两种方法优劣。
1 材料和方法。
1.1 试剂与仪器：FACS Calibur型流式细胞仪（美国B.D公司）；XD—101倒置显微镜（江南制造厂）；台盼蓝和碘化丙啶（均为Sigma公司）。
1.2 测定标本：10只Sprague—Dawley(SD) 大鼠，雌雄兼用，由徐州医学院实验中心提供，按文献的方法［2］制备成胰腺冷缺血模型，切取胰腺组织，检测各项指标。
1.3 单细胞悬液的制备：在无菌条件下，取胰腺放入平皿中，用磷酸缓冲液（PBS）除去胰腺组织表面的血液及血凝块，从同一大鼠胰腺取大小约0.5 cm3两新鲜组织块，分别用剪碎和研磨2种方法制备组织悬液。
1.3.1 剪碎法：将组织块放入平皿后，加入少量PBS；用眼科剪将组织剪至匀浆状，加入10 ml PBS；用吸管吸取组织匀浆，用200目尼龙网过滤到试管内；离心沉淀1500 prm×3 min，再用PBS洗3次，每次以500 prm短时低速离心除去细胞碎片，以300目尼龙网过滤去细胞团块。作细胞计数并调整细胞浓度为（2～5）×106 /ml。常温下放置, 待测细胞的活力。
1.3.2 匀浆器法：用眼科剪将组织剪成小块；放入70 ml组织研磨器内，加入2 ml PBS；缓慢转动研棒，研磨至匀浆；用10 ml PBS冲洗研器；收集细胞悬液，经300目尼龙网过滤；离心沉淀800 prm×2 min ，再用PBS洗3次，离心沉淀。以下处理同剪碎法。
1.4 形态学观察及细胞活性测定：取制备好的胰腺细胞悬液，在相差倒置显微镜下观察其形态学变化；取9滴各组细胞悬液,加一滴台盼蓝溶液混匀后，于4℃冰箱静置20 min，用血小板记数板在光镜下分别记数活细胞和死细胞。
1.5 荧光染色：取细胞悬液，用70%预冷乙醇固定过夜，然后用4℃ PBS洗涤2次。加入0.5 ml PBS悬浮细胞，再加入50 μg/ml 碘化丙啶染色，4℃避光染色，过200目尼龙网，上FCM检测。应用CellQuest软件自动获取10000细胞/样品，ModFit LT软件进行DNA含量分析。主要检测指标：细胞凋亡水平（APO）、G0/G1细胞比率、DNA指数（DNA index，DI）、S期细胞比率（SPF）、CV值。
1.6 统计学处理：所有数据用均数±标准差（ ± s）表示，采用配对t检验做差异显著性分析。