激活素A和卵泡抑素对冻融人胎儿卵巢雌二醇分泌的影响
作者：池海虹，周颖，祝怀平，金畅，叶碧绿。
Abstract: Objective:To investigate the effect of Activin A—follistatin on steroidogenesis of frozen—thawed human fetal ovary in vitro. Methods: The frozen—thawed fetal ovarian tissue was cultured individually in minimal essential medium (MEM) for 8 days. Under the experimental conditions, the medium was supplemented with either Activin—A (Act A group) or follistatin (FS group) or the combinations of Activin—A and follistatin (A+F group). The concentration of E2 in cultured medium was detected with immunoluminescence method. Results: The levels of E2 at 4th day, 6th day and 8th day were higher than that at 2nd day (P0.05), The secretion of E2 increased at first, then decreased with the highest level at 6th day. The level of E2 of Act A group was significantly greater than that of the control group, FS group and A+F group (P0.01). Conclusion: Frozen—thawed human fetal ovary can excrete estrodiol under the condition of tissue culture. Act A can increase the excretion of estrodiol in cultivated ovarian tissue, and the effection of Act A can be suppressed by FS.
Key words: activin A; follistatin; fetal; ovarian tissue; estrodiol。
近年来发现的一组性腺起源的细胞因子——激活素(Activins)，对卵泡发育有着重要的局部调节作用，尤其是激活素A(Activin A，Act A)。尽管有较多的研究表明了激活素对不同动物卵泡发育的影响[1—3]，但对人胎儿卵巢内卵泡发育的影响尚未见报道。本研究以胎儿卵巢为研究对象，比较Act A和卵泡抑素(FS)在体外组织培养条件下对冻融人胎儿卵巢E2分泌的影响，探讨其在人卵泡发生过程中可能的调节作用。
1 材料和方法。
1.1 标本 卵巢组织取自因计划生育或医疗原因需行药物引产（利凡诺＋米菲司酮）的32周胎儿（温州医学院教学医院分娩室提供）共3例，于引产后2 h内无菌条件下取材，置于预冷的Leiboviz—15(L—15，美国sigma公司产品)基础培养液中待用。本研究经我院伦理委员会批准。
1.2 试剂和仪器 基础培养液为MEM培养液(购自GIBCO公司)，含5%小牛血清，100 U/ml的FSH, 100 IU/ml青霉素和100 IU/ml链霉素，1/100 ITS(胰岛素—转铁蛋白—硒，insulin—transferrin—selenium)，pH 7.0～7.2。Act A、FSH、FS均为Sigma公司产品。E2测定采用美国贝克曼库而特公司BXI800仪器及试剂。
1.2 实验方法。
1.2.1 冷冻及复苏: 将胎儿卵巢组织去除髓质及周围结缔组织后，切成5 mm×5 mm×1 mm大小，放入装有冷冻保护剂1.5 mol/L丙二醇（PROH）的冷冻管中，按照Oktay[4]提出的慢冻速融法处理。
1.2.2 体外培养及分组:冻融卵巢皮质块切成2 mm×2 mm×1 mm大小，随机放入加有0.8 ml培养液的24孔培养板内，37 ℃、5%CO2培养箱内培养，隔天半量换液，共培养8 d。实验共分四组：MEM组（Minimum Essential Medium，基础培养液）即对照组、Act A组（基础培养液+100 ng/ml Act A）、FS组（基础培养液+100 ng/ml FS）和A+F组（基础培养液+100 ng/ml Act A+100 ng/ml FS）；每组4块组织。所有实验重复3次。
1.2.3 E2的测定: 收集培养2 d、4 d、6 d、8 d的培养液，采用免疫发光法，按美国贝克曼库而特公司BXI800仪器及试剂说明测定E2的含量。质控符合要求,批内变异系数10%，批间变异系数15%。
1.3 统计学处理方法 采用重复测量资料方差分析进行比较，采用Dunnet进行两两比较。
2 结果。
所有培养组的卵巢组织，培养4 d、6 d、8 d分泌的E2值均高于2 d值，差异有显著性（均P＜0.05），总体呈先增加后减少改变，在培养后6 d可达较高水平；Act A组E2分泌量明显高于对照组、FS组和A+F组，差异有显著性（均P＜0.01），详见表1。
3 讨论。
3.1 胎儿卵巢组织体外培养条件下能分泌E2 本实验结果显示，胎儿卵巢组织在体外培养条件下能产生E2。目前，国内外对卵巢组织体外培养的最佳时间尚无定论，除鼠卵巢组织外，其他哺乳动物的卵巢组织即使体外培养20 d，组织内的初级卵泡也不能发育到次级卵泡阶段[5]。本研究中E2分泌量随培养时间延长先增加后减少，在培养后6 d可达较高水平，这是否提示人胎儿卵巢组织的体外最佳培养时间为6 d尚有待进一步研究。