重组HIF1α真核表达质粒转染成骨细胞的条件优化

作者：陆蕴松 刘光耀 高忠礼。

【摘要】 目的 优化重组低氧诱导因子（HIF）1α真核表达质粒转染成骨细胞的条件，为进一步检测重组HIF1α真核表达质粒对成骨细胞功能的调控作用提供基础。方法 将连有增强型绿色荧光蛋白（EGFP）的重组HIF1α真核表达质粒转染进成骨细胞中，应用不同量的质粒和脂质体在转染24 h后在荧光显微镜下观察并计算转染效率。结果 在24孔培养板中，转染24 h后10 μg质粒和5 μl脂质体的条件下转染效率最高。结论 通过对转染条件的优化，可提高转染效率。

【关键词】 重组低氧诱导因子；成骨细胞。

低氧诱导因子1（HIF1）是缺氧条件下的一个重要的氧依赖转录激活因子，在低氧状态下对成骨细胞有促进成骨功能，其对骨折愈合的功能调控都是在低氧环境下实现的〔1〕。采用脂质体介导的重组HIF1α真核表达质粒转染成骨细胞，其转染效率可因脂质体和质粒量的不同而有差别。本研究旨在优化重组质粒转染成骨细胞的各种参数以提高转染效率，为下一步研究重组质粒对成骨细胞功能的调控提供研究条件。

1 材料与方法。

1.1 材料 重组质粒增强型绿色荧光蛋白（EGFP）HIF1α由本实验室构建〔2〕，DMEM培养基和OptiMEM购自Gibco公司，胎牛血清购自Hyclone公司，胰蛋白酶购自Difco公司，Ⅱ型胶原酶及Lipofectamine 2000购自Invitrogen公司。

1.2 方法。

1.2.1 重组质粒的制备 应用上海博亚公司质粒提取试剂盒提取。

1.2.2 成骨细胞的分离和培养 将4只1～3 d龄的Wistar大鼠，引颈处死，放入75%乙醇中浸泡2 min。无菌取颅盖骨，置于含有PBS液的培养皿中，尽量剔除附在颅盖骨上的血管和结缔组织。加入2 ml的（0.25%）胰蛋白酶，于37℃气浴振荡，预消化20 min后终止消化，PBS液清洗。再将颅盖骨剪成1 mm×1 mm 碎块，加入2 ml的0.1%Ⅱ型胶原酶，37℃气浴振荡消化1h，终止消化，液体移入另一离心管，1 500 r/min离心10 min，弃去上清液，沉淀即为成骨细胞。用含10%胎牛血清的DMEM培养液重悬，吹打均匀，接种至培养瓶。37℃，5%CO2饱和湿度下培养24 h后换液，以后每3 d换液1次。待细胞长满后，用0.25%胰蛋白酶反复消化传代以提高成骨细胞纯度。

1.2.3 成骨细胞的鉴定 碱性磷酸酶（ALP）染色观察（本实验采用改良的钙钴法），将成骨细胞以适合密度接种内置盖玻片的6孔培养板内，待细胞铺展均匀后，以90%乙醇固定10 min，水洗，将涂片放入孵育液（临时配制，孵育液成分为：2%甘油磷酸钠25 ml，2%巴比妥钠25 ml，蒸馏水50 ml，2%氯化钙5 ml，2%硫酸镁2 ml，氯仿5～8滴）中，37℃孵育4 h。再水洗。用2%硝酸钴溶液作用5 min，流水充分洗净多余的硝酸钴，浸入1%硫化铵溶液中2 min。流水冲洗，待室温干燥，甘油明胶封片。自然干燥、封固，光学显微镜下观察成骨细胞。

1.2.4 细胞转染条件优化 以3×104/ml的密度将成骨细胞接种到24孔板上的9孔中。细胞达到90%～95%融合开始转染。溶液1：200 μl无血清培养基分别加入3、5、10 μl的Lipofectamine 2000温育10 min；溶液2：200 μl无血清培养基分别加入3、5、10 μg质粒。将溶液1与溶液2混合成溶液3，室温放置30 min。用无血清培养基冲洗细胞，加入适量无血清培养基。将不同含量溶液3的混合液逐滴加入9孔中，摇动培养板，轻轻混匀。在37℃，5％CO2中作用6 h。更换含有血清的全培养基，在37℃，5％CO2中培养24 h后在荧光显微镜下观察转染效率。

1.2.5 转染效率测定 应用荧光显微镜，在可见光先固定一个视野，计数细胞总数，然后换成荧光下计数能发出绿色荧光的细胞。能发出绿色荧光的细胞数与总细胞数之比即为成骨细胞转染效率。