大鼠肝缺血/再灌注后肝组织一氧化氮和不同亚型一氧化氮合酶的变

【摘要】 目的 探讨一氧化氮（NO）和一氧化氮合成酶（NOS）在肝缺血/再灌注（I/R）过程中的变化和作用。方法 健康雄性SD大鼠24只，随机分为3组（每组8只）：①正常对照组，术中只分离肝周围韧带，不做肝门阻断及再灌注。②I/R组，进行45 min的部分肝门阻断及60 min的再灌注。③L—精氨酸(L—Arg)组，缺血前20 min经阴茎背静脉注射L—Arg（300 mg/kg），余同②组。实验结束后，取下腔静脉血2 ml，并迅速切取缺血肝组织。检测血清丙氨酸转氨酶(ALT)、门冬氨酸转氨酶 (AST)、乳酸脱氢酶(LDH)；测定肝组织中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、黄嘌呤氧化酶（XOD）、一氧化氮（NO）和一氧化氮合成酶（NOS）等指标；观察光镜和电镜下肝组织学变化。结果 与正常对照组相比，I/R组iNOS升高，NO降低；L—Arg组NO、eNOS均高于I/R组。2、3 组比1组大鼠的肝组织病理损害重、肝功能差， L—Arg组病理损害较I/R组明显减轻、肝功能改善。结论 NO对大鼠肝I/R损伤具有保护作用，不同亚型NOS的变化参与其中。

【关键词】 一氧化氮 一氧化氮合酶 肝 再灌注损伤 大鼠 缺血预处理。

Changes of nitric oxide and nitric oxide synthase during hepatic ischemia/reperfusion of rat。

Abstract Objective To explore changes and effects of nitric oxide(NO) as well as nitric oxide synthase (NOS) during liver ischemia/reperfusion (I/R) injury of rats. Methods Twenty—four healthy male SD rats were randomly divided into 3 groups (8 animals per group). Group 1 was served as sham operated control. Both Group 2 and Group 3 were subjected to 45 min lobar， rather than total hepatic ischemia and 60 min reperfusion. Group 3 were pretreated with L—Arg (300 mg/kg) via the dorsal penis vein additionally. Blood samples (2 ml) were drawn from inferior vena cava for biochemistry tests， such as ALT， AST， and LDH. Injured liver lobes were excised for histology and testing SOD， MDA， XOD， NO and NOS. Results Rats in group 2 showed significantly higher iNOS levels and lower NO levels than those in group 1. NO and eNOS were increased in Group 3 compared with those in group 2 （P0.05）. The L—Arg administration significantly reduced the hepatic lesions. Conclusion NO has a protective effect on liver I/R injury in rats， and different isoforms of NOS may be involved in this process.

Key words nitric oxide； nitric oxide synthase； liver； reperfusion injury； rats； ischemic preconditioning。

肝缺血/再灌注（ischemia/reperfusion，I/R）损伤常见于许多临床病理过程和肝脏手术过程，如出血性休克、肝切除和肝移植等。近年来，一氧化氮 （nitric oxide，NO）在肝I/R损伤中的作用日益受到重视，但在此过程中NO究竟起有益还是有害的作用以及相关机制，目前仍无一致的看法[1—2]。本实验复制大鼠部分肝I/R损伤模型，观察肝组织NO和不同亚型一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）等指标的变化及意义，为临床加强围手术期肝脏的保护提供实验依据。

1 材料和方法。

1.1 动物与分组 健康雄性SD大鼠(苏州大学医学院实验动物中心提供)24只，质量为200～300 g。随机分为3组（每组8只）：①正常对照组，②I/R组，③L—Arg组。

1.2 动物模型准备 大鼠术前禁食12 h，自由饮水；20%乌拉坦作腹腔注射麻醉[0.5 ml/100 g(体质量)]。麻醉生效后，上腹正中切口进腹， 游离肝左外侧叶周围韧带，显露肝左外叶肝蒂。显微手术用动脉夹阻断第5叶肝蒂，令该叶（约占肝总容积的30%）进入缺血状态，这样可避免因全肝血流阻断造成的胃肠淤血以及细菌移位对实验的影响；恢复被阻断肝叶血供，即建立部分肝I/R模型。1组麻醉后同样进行腹部手术，但不阻断肝脏血供。2组施行45 min的肝门阻断及60 min的再灌注。3组缺血前20 min经阴茎背静脉注射左旋精氨酸（L—Arg，300 mg/kg），余同2组，手术过程适当补充生理盐水2 ml。再灌注60 min 时结束实验，各组于相同时点直接穿刺下腔静脉取血2 ml，离心（3 000 r/min）留血清用以检测血清生化指标丙氨酸转氨酶(alanine aminotransferase，ALT)、门冬氨酸转氨酶（aspartate aminotransferase，AST）及乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)。随即处死大鼠，迅速切下被阻断的肝叶，剪取 0.5 cm × 0.5 cm 大小的组织块，以10%福尔马林液固定，待制常规切片；剪取0.1 cm × 0.1 cm肝组织2粒，电镜固定液（4%戊二醛）固定，待制超薄电镜切片。余肝组织暂放入液氮灌再转入超低温冰箱待测其他生化指标。

1.3 主要检测指标和方法 TMS1024全自动生化分析仪（TOKYO BOKEI MEDICAL Co.）测定血ALT、AST、LDH。肝组织超氧化物歧化酶 (superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondiaehyde，MDA)、黄嘌呤氧化酶(xanthine oxidase，XOD)，NO，NOS检测试剂盒均购自南京建成生物工程公司，NOS检测2种亚型：诱导型(inducible NO synthase，iNOS)和内皮细胞型(endothelial cell NO synthase，eNOS)。严格按试剂盒说明书操作，准确称取肝组织质量，按一定比例加生理盐水，制成匀浆，3000 r/min，离心10 min，取上清检测，设对照管，读测定管OD值，然后换算SOD、XOD、NOS 活力和MDA、NO含量。取出经福尔马林固定的标本，经冲水→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→HE染色→封固，光镜下观察肝脏病理改变并拍照。将4%戊二醛固定后的肝组织标本，梯度乙醇脱水，Epon812包埋，超薄切片，铅铀染色，HA—600透射电镜（HITACHI CO.JAPEN）观察超微结构变化。