细胞悬液法与组织块埋植法制作兔VX2肝癌影像模型的对照研究
作者：郭兴 丁伟 李雪鹏 宋惠坤。
【摘要】 目的：通过对照细胞悬液法与组织块埋植法，选择较合理的兔VX2肝癌模型的造模方法。方法：取传代荷瘤VX2种兔，分离肿瘤，制备肿瘤细胞悬液和肿瘤组织块，取新西兰大白兔各10只，分别经超声导引肝内注射和开腹肝内组织块埋植，3周后处死模型兔，观察原位肿瘤大小，肝内、腹腔及肺部转移情况。结果：两种方法造模，成模率均为100％；组织块埋植法组原位肿瘤体积明显大于细胞悬液组；组织块埋植造模较少引起异位种植，肿瘤生长较为均一。结论：组织块埋植法优于细胞悬液法。
【关键词】 VX2 肝癌 动物模型。
Abstract Objective:To choose a better method to make a rabbit VX2 liver cancer model through cell suspension injecting and tissue lump embedding. Methods： After separating the tumors in cancer bearing VX2 rabbit, cells suspension and tissue lump were prepared. Then the cells suspension was injected into ten New —Zealand albino rabbits livers through hypersound .And tissue lumps were embedded into another ten New —Zealand albino rabbits livers .After 3 weeks, model rabbits were executed ,the size of tumors ,intra—liver, enterocoelia, bellows transfer were recorded. Results： The achievement ratio of VX2 model was 100% for these two methods. The size of tumor in tissue lump embedding group was significantly larger than cell suspension injecting group. Ectopia plant was much less in tissue lump embedding group, and the tumors were uniform. Conclusion： The method of tissue lump embedding was better than cell suspension injecting. Key words VX2；Liver cancer；Rabbit model。
VX2肿瘤细胞株是由shope病毒诱发兔乳头状瘤衍生的鳞状细胞癌，经过移植传72代后正式建株、命名［１，２］。由于兔缺乏对VX2细胞的免疫，可直接移植至肝、肾、肌肉等器官建立原位模型［３］，是目前较常使用的医学影像模型。文献报道VX2肝癌模型的制作方法主要包括细胞悬液法和组织块埋植法，本研究通过两种造模方法对照，以探讨较为简便实用，成模率高的模型制作方法。
1 材料和方法。
1.1 材料 新西兰大白兔40只，2 kg～2.2 kg，雌雄各半，四川大学实验动物中心提供, 合格证号：10）荷瘤VX2种兔 (由华中科技大学介入科冯敢生教授惠赠)，超声诊断仪（惠普HDI 5000，美国），CO2孵箱(SANYO, MCO—17A2,日本)，倒置显微镜（OLYMPUS, 日本），血细胞计数板，DMEM培养液（自制），PBS缓冲液（自制），显微手术器械。
1.2 方法。
1.2.1 细胞悬液及肿瘤组织块制备：取传代中大腿荷瘤种兔一只，提前一天大腿内侧备皮，腹腔内注射10％水合氯醛2.5 mL/kg，安定2.5 mg/kg，麻醉后，碘伏大腿内侧及腹股沟区消毒，剪开局部皮肤，分离皮下组织，细心分离肿瘤，将肿瘤完整取出。剪开肿瘤，置于37 ℃PBS缓冲液的培养皿中，用解剖镊细心分离肿瘤组织，将血管及坏死组织分离清除干净，置于盛DMEM培养液的培养皿中，取鱼肉样肿瘤组织分别制备细胞悬液和组织块：用眼科剪剪碎成约1 mm３大小， 2 mL匀浆器匀浆，制备细胞悬液，血细胞计数板计数，DMEM培养液调整细胞浓度，达到107 cell/mL；将肿瘤组织剪成约4 mm×4 mm×4 mm大小组织块，置DMEM培养液中。细胞悬液及组织块制备完成后，放入5％CO2孵箱待用。以上操作在超净工作台完成，保证无菌。
1.2.2 肿瘤肝内接种：健康2 kg～2.2 kg新西兰大白兔20只，随机数字表法随机分为组织块组和细胞悬液组，分别采取如下方法行肿瘤接种，组织块组：兔上腹部提前一天备皮，麻醉后固定于兔台，消毒上腹部皮肤、铺无菌单，剑突下3 cm纵行切开约2 cm～3 cm切口，暴露肝脏，用手术刀柄将肝左外叶轻轻挑出，使用1号丝线穿过肝脏，慢慢将肝脏拉出切口，无菌纱布保护切口，在肝左外叶有肝左中叶覆盖部分用眼科剪剪约0.5 cm的小口，用解剖镊伸入切口沿肝脏走行方向造成深约1 cm的隧道，镊取已经准备好的4 mm×4 mm×4 mm 的肿瘤组织塞入隧道内，剪取一小块明胶海绵填堵切口。抽出一号丝线，将肝脏慢慢送入腹腔后关腹;细胞悬液组：动物术前准备同前组，固定、麻醉完成后，置于超声检查床，抽取细胞悬液0.2 mL，超声导引下经皮穿刺，将细胞悬液注入肝左外叶。接种完成后连续3 d肌注青霉素5万 U/kg，庆大霉素2.5 mg/kg(或0.25万U/kg)。
1.2.3 成瘤观察：按以上两种方法接种完成后，送动物室饲养3周，按肿瘤接种麻醉方法麻醉荷瘤兔，触摸心脏波动最强烈部位，用10 mL注射器心脏穿刺，注射空气，处死。剖腹，观察腹腔内肝外脏器、腹腔（包括壁层腹膜及网膜）及腹壁有无肿瘤种植，并记录。分离肝脏将肝脏完整取出，观察肝脏表面肿瘤原种植部位肿瘤大小，分离出肿瘤，使用游标卡尺测量肿瘤最长径(a)及短径(b)，按以下公式计算肿瘤体积（V）：V (cm3) =πab2/6。同时观察肝脏表面其他部位有无转移病灶。
1.2.4 统计学分析：采用SPSS 13.0统计软件，描述性统计分析，肿瘤大小比较符合参数检验条件，两组数据比较采用t检验，肿瘤成模率及异位转移比较采用Fisher’s确切概率法检验。
2 结果 组织块接种组肿瘤体积明显大于细胞悬液接种组，差异有统计学意义，且前者极差及变异系数明显小于后者，统计结果见表1；除组织块组其中一只因腹泻死亡，两组存活动物肝内均有肿瘤生长；组织块组和细胞悬液组发生腹腔、肝内和肺内转移的比例分别：22％、33％、0％和80％、100％、20％，组织块组较少发生异位种植，两组间差异有统计学意义，统计结果见表2。