凋亡相关基因pnas2的表达与白血病关系

作者：黄洪晖，朱坚轶，钟济华，王海嵘，钟华，韩洁英，陈芳源。

【摘要】 本研究旨在探讨凋亡相关基因pnas2与白血病的关系。应用RTPCR技术检测硫化砷作用前后NB4、K562、U937细胞pnas2基因的表达及急性白血病病人治疗前后pnas2基因表达的变化。结果显示： NB4细胞在硫化砷作用后pnas2表达有明显下调，并呈时间依赖性；而K562及U937细胞在硫化砷作用后pnas2基因的表达无明显变化。急性白血病病人治疗前pnas2基因表达阳性率为100%，显著高于正常对照组；经非硫化砷诱导化疗后，完全缓解病人pnas2基因的表达全部转为阴性；而未达到缓解的病例pnas2基因的表达仍为阳性，较化疗前无明显变化。结论：pnas2基因可能与硫化砷诱导APL细胞凋亡密切相关，同时其表达有可能作为急性白血病分子生物学缓解的指标之一。

【关键词】 白血病。

Correlation between Expression of ApoptosisRelated Gene pnas2 and Leukemia。

Abstract The study was purposed to explore the correlation between apoptosisrelated gene pnas2 and leukemia. The RTPCR was performed to detect the expression levels of pnas2 gene in NB4, K562, U937 cells before and after treatment with AS4S4, and to analysis the expression change of pnas2 gene in bone marrow cells from patients with acute leukemia before and after chemotherapy. The results showed that the expression of pnas2 gene in arsenic sulfide treated NB4 cells was down regulated in timedependent manner, but the same outcome in K562 and U937 cells after being treated with AS4S4 was not found. The positive expression rate of pnas2 in cells from untreated patients with acute leukemia was 100%, and was significantly higher than that in normal control group. After chemotherapy, the expression was negative in complete remission patients, whereas in noremission patients there were no significant differences of expression of pnas2 before and after treatment. It is concluded that the pnas2 gene may be closely related with apotosis of arsenic sulfide treated APL cells, and may consider as a molecular biological remission marker in acute leukemia.

Key words pnas2 gene； Arsenic Sulfide； leukemia。

pnas2基因是细胞凋亡相关蛋白的编码基因，有资料显示它是一条与NB4细胞凋亡密切相关的基因，但尚未见具体报道。本实验室在前期工作中，用基因表达谱芯片检测NB4细胞在硫化砷作用前后基因表达的变化，结果发现硫化砷处理后的NB4细胞有34条基因表达发生改变，分别涉及细胞凋亡、细胞周期、细胞信号转导、DNA合成，转录及修复、蛋白质翻译等相关基因，其中与凋亡密切相关的pnas2基因表达下调［1］。本实验基于基因表达谱芯片的结果，采用RT－PCR方法研究硫化砷作用于NB4、K562、U937细胞后pnas2基因的表达变化，并检测了急性白血病病人化疗前后pnas2基因的表达，力图进一步探索pnas2基因与白血病的关系。

材料和方法。

血液肿瘤细胞株及培养。

取NB4、K562、U937细胞（NB4细胞株由上海血液学研究所陈竺所长馈赠）1×105个细胞/毫升置于不含或含10 mg/L As4S4（美国AlfaAesar公司，纯度99.99%）的新鲜培养液（RPMI 1640， Gibco公司产品）中（含10％小牛血清，1 mmol/L谷氨酰胺，1 mmol/L丙酮酸及100 U/ml青霉素，100 U/ml链霉素），于37℃、5％ CO2、湿空气中培养，2、4、6、8小时后收集细胞。

本院住院及门诊初发急性白血病病人9例，其中男6例，女3例，年龄18—57岁，中位年龄47岁，按MIC分型标准诊断，其中急性淋巴细胞白血病（ALL）1例；急性髓系白血病（AML）8例，包括M2 2例，M3 2例，M4 3例，M5 1例。诱导缓解方案为：对ALL病人采用DVP（柔红霉素，长春新碱，泼尼松）方案；AML病人采用DA（柔红霉素，阿糖胞苷）或MAV（米托蒽醌，阿糖胞苷，鬼臼噻吩甙）或CAG（阿克拉霉素，阿糖胞苷，粒细胞集落刺激因子）等方案；对M3病人采用全反式维甲酸（ATRA）治疗。以完全缓解（CR）作为判断疗效指标。对照组4例，为类白血病反应1例，特发性血小板减少性紫癜病人3例。

单个核细胞的分离。

采集患者骨髓液10 ml，肝素抗凝。Ficoll淋巴细胞分离液分离单个核细胞，获得的细胞标本中白血病细胞比例均达80％以上。Ficoll分离法操作如下：抗凝骨髓4—6 ml，用等量生理盐水稀释后，沿管壁缓慢加入已放有4—6 ml Ficoll淋巴细胞分离液的试管中， 400×g室温离心20分钟，吸出单个核细胞层，用生理盐水洗涤2次。如混杂有红细胞，用4—6 ml红细胞裂解液4℃放置8分钟， 100×g离心5分钟，沉淀，加入5 ml生理盐水洗涤，用计数板计数，计算细胞总数。洗涤后细胞沉淀，加入TRIZOL 1 ml， —80℃冷冻保存待用。

总RNA抽提。

TRIZOL总RNA抽提试剂盒购自Gibco公司。具体步骤如下：收集5×106细胞，用冰PBS洗涤1次，转移至1.5 ml的离心管内，加1 ml TRIZOL，室温孵育5分钟；加200 μl 纯氯仿，剧烈振荡15秒，室温孵育3分钟；4℃， 1 5000×g离心20分钟，取无色液体层到新管中；加入500 μl 异丙醇沉淀总RNA，混匀，—20℃放置60分钟；4℃， 1 5000×g离心20分钟；弃上清，加1 ml 75％乙醇，抽打，将沉淀打碎，混匀，4℃， 1 5000×g心20分钟；小心吸除上清液，保留RNA沉淀；空气干燥10分钟至沉淀透明；用15 μl DEPC水溶解。取1 μl RNA样品溶液，以DEPC水稀释至100 μl，置于比色杯中，于分光光度仪上检测总RNA含量及OD260/OD280比值，电泳检测RNA有无降解。

cDNA合成。

逆转录试剂盒购自TaKaRa公司。RNA模板预先于70℃ 10分钟变性，立即置于冰上5分钟。整个逆转录体系50 μl，瞬时离心后，置30℃，10分钟，50℃，30分钟，5℃，5分钟进行逆转录。

聚合酶链反应。

PCR试剂盒购自TaKaRa公司。 扩增引物序列及扩增片段如下： pnas2，上游引物 5‘ ACAATCTTGCCCAACAGTCATT3‘， pnas2，下游引物 5‘ TTCCCATTCCTTAGTTTTATTC3‘，pnas2扩增片段为722 bp。

内参照引物序列及扩增片段如下： βactin，上游引物 5‘ TCGACAACGGCTCCGGCAT3‘， βactin，下游引物 5‘ AAGGTGTGGTGCCAGATTTTC3‘，βactin扩增片段为241 bp。

PCR反应体系共50 μl： 2×mRNA Selective PCR Buffer Ⅱ 20 μl，MgCl2 8 μl，dNTP 4 μl， AMV－optimized Taq 1 μl，pnas2 上游引物 1 μl，pnas2 下游引物1 μl，βactin上游引物0.5 μl，βactin下游引物0.5 μl，cDNA 5 μl，灭菌水9 μl。瞬时离心，置于PCR扩增仪上，85℃低温变性，进行35个循环，循环条件： 85℃变性45秒，55℃退火45秒，72℃延伸90秒，最后延伸7分钟结束反应。

PCR产物电泳。

PCR产物6 μl在1.5％琼脂糖凝胶中电泳后，置紫外灯下观察、成像，记录于凝胶数字成像系统，分别测定pnas2和βactin基因扩增产物的光密度值，计算pnas2基因和βactin基因的相对比。