高效液相色谱法测定甘草苷和甘草酸含量的研究
【摘要】 目的建立甘草苷和甘草酸的HPLC含量测定方法。方法使用KromasiL—C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）柱，甘草苷采用乙腈—0.5%醋酸(20:80)为流动相，检测波长276 nm，柱温为室温；甘草酸流动相为甲醇—0.2 mol·L—1乙酸铵溶液—冰乙酸(67∶32∶1)，检测波长252 nm，柱温为室温。二者流速均为1.0 ml·min—1，采用外标法定量测定。结果甘草苷在2.7～27 μg·ml—1范围内呈良好线性关系（r=0.999 7）；甘草酸在6～36 μg·ml—1范围内呈良好线性关系（r=0.999 8）；甘草苷和甘草酸的平均回收率分别为101.4%和101.3%，其RSD值分别为1.18%和1.22%。结论该方法操作简便、准确，线性相关系数良好，且稳定性和重复性好，适用于甘草黄酮粗提物及纯化物中甘草苷和甘草酸的含量测定。
Abstract：ObjectiveTo establish method for determination of liquiritin and glycyrrhizic acid by HPLC.MethodsKromasil—C18 column(4.6 mm×200 mm,5 μm)was used, HPLC analysis for liquiritin was performed with room temperature and the mobile phase consisted of acetonitrile—0.5% glacial acetic acid(20∶80),the detection wavelength was at 276 nm; HPLC analysis glycyrrhizic acid was performed with room temperature and the mobile phase consisted of methanol—0.2 mol·L—1 ammonium acetate—glacial acetic acid(67∶32∶1), the detection wavelength was at 252 nm. The flow rate was 1.0 ml·min—1. ResultsThe linear range of liquiritin was obtained between 2.7～27μg·ml—1 (r=0.9997); the linear range of glycyrrhizic acid was obtained between 6～36μg·ml—1 (r=0.999 8); the average recovery of liquiritin and glycyrrhizic acid were 101.4% and 101.3% respectively with corresponding RSD of 1.18% and 1.22%. ConclusionThis method is simple, convenient stable,repeatable and accurate with good linear relationship. It is suitable for the determination of liquiritin and glycyrrhizic acid in extraction and purification of licorice flavonoid.
Key words：HPLC； Liquiritin； Glycyrrhizic acid。
甘草是新疆蕴藏量大、药用价值高的一种荒漠草原药用植物，其主要有效成分为甘草酸和黄酮类化合物。甘草黄酮具有明显的抗肿瘤、抗溃疡、抗菌、抗变态反应、降血脂和镇痛的作用，并对爱滋病病毒有很强的抑制增殖作用［1，2］，是甘草有效成分开发的热点。经典的黄酮含量测定方法，是以芦丁为对照品，采用紫外分光光度法测定［3～5］，但此方法用于甘草黄酮的测定尚有诸多不足之处。甘草黄酮的主要成分甘草苷，是反映甘草黄酮内在质量的一个重要指标［6］。本研究以甘草苷为对照品，采用HPLC法测定甘草黄酮含量的方法，同时研究优化以HPLC测定甘草酸含量的方法，以期为甘草有效成分的综合开发利用和质量监控提供新的方法和思路。
1 仪器与材料。
1.1 仪器 LC—10A高效液相色谱仪(日本岛津)；SPD—10A可变紫外检测器(日本岛津)；万分之一天平（Sartorius）；KQ—250B型超声波清洗器(上海之信仪器有限公司)。
1.2 材料 甘草(石河子天德中药厂)。甘草苷对照品、甘草酸单铵盐对照品(均购自中国药品生物制品检定所)；95%乙醇(A.R)、冰醋酸(A.R)、乙酸胺(A.R)、甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）。
2 方法与结果。
2.1 色谱分析条件。
2.1.1 甘草苷检测条件色谱柱为KromasiL—C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流动相为乙腈—0.5%醋酸(20∶80)；紫外检测波长：276 nm；流速1.0 ml·min—1；柱温为室温；进样量20 μl。理论塔板数按甘草酸铵峰计算应不低于4 000。对照品和甘草黄酮粗提物的色谱图见图1～2。
2.1.2 甘草酸检测条件色谱柱为KromasiL—C18（4.6 mm×200 mm，5 μm）；流动相为甲醇—0.2 mol·L—1乙酸铵溶液—冰醋酸(67∶32∶1)；紫外检测波长252 nm；流速1.0 ml·min—1；柱温为室温；进样量20 μl。理论塔板数按甘草酸铵峰计算应不低于2 000。对照品和甘草黄酮粗提物分离的色谱图见图3～4。
2.2.1 对照品溶液的配制 取甘草苷和甘草酸单铵盐对照品适量，精密称定，用流动相配制成浓度为54 μg·ml—1的甘草苷对照品溶液和120 μg·ml—1的甘草酸单铵盐对照品溶液。
2.2.2 供试品溶液的制备 精密称取甘草黄酮提取物适量，用相应的流动相溶解，定溶于10 ml量瓶中,作为甘草苷供试品溶液。