青天葵中两种黄酮提取工艺的正交实验优选

作者：周燕园， 甄汉深， 袁叶飞， 钟振国。

【摘要】 　　目的优选青天葵中两种黄酮类成分—鼠李柠檬素和鼠李秦素的最佳提取工艺条件。方法采用正交实验进行提取方法的研究，用HPLC法测定两种黄酮的含量。结果在选定的色谱条件下, RP—HPLC方法较好，结果理想。青天葵中两种黄酮的最佳提取工艺为加75%甲醇20 ml，超声提取60 min。结论建立了准确可靠、分析速度快可同时检测青天葵中两种黄酮的分析方法，优化了质量可控的提取工艺。

【关键词】 青天葵 鼠李柠檬素 鼠李秦素 高效液相色谱法 正交实验。

Abstract:ObjectiveTo optimize the extraction process of two flavonoids rhamnocitrin and rhamnazin from Nervilia fordii(Hance) Schltr..MethodsThe extraction method was optimized by orthogonal experiment and the contents of two flavone compounds were determined by HPLC.ResultsUnder the optimized chromatographic condition, the RP—HPLC was simple, rapid and accurate. The optimum extracting procedure was as follows:20 ml 75% methanol and ultrasonic extraction for sixty min. ConclusionThe method is set up and it can simultaneously, rapidly and accurately detect two flavone compounds extracted from Nervilia fordii(Hance) Schltr.. The modified extraction technology of Nervilia fordii(Hance) Schltr. is stable and reliable.

Key words:Nervilia fordii(Hance) Schltr.; Rhamnocitrin; Rhamnazin; HPLC; Orthogonal design。

青天葵别名青莲、入地珍珠、假天麻、独叶莲、独脚莲、山米子、半边伞等［1］，来源于兰科植物毛唇芋兰Nervilia foadii(Hence) Schltr. 的全草，入药始载于《岭南采药录》，是广西特产药材，也是我国传统中药出口创汇的主要药材。性平，味苦、甘，有清肺止咳、清热解毒、散瘀止痛之功效。主治肺痨咯血、肺热咳嗽、口腔炎、咽喉肿痛、瘰疬、疮疡肿毒、跌打损伤等［2～4］。在目前对青天葵化学成分的研究中［5～7］，已分离鉴定出有黄酮、三萜、氨基酸、有机酸、甾体类化学成分。其中鼠李柠檬素与鼠李秦素是两种重要黄酮类成分，经本课题小组实验研究表明,鼠李柠檬素有抗肿瘤作用［8］,鼠李秦素具有抗氧化活性［9,10］。由于黄酮是青天葵的主要有效成分，且鼠李柠檬素与鼠李秦素在青天葵中的含量均较高，因此本实验以鼠李柠檬素和鼠李秦素的峰面积作为考察指标，采用正交实验法对青天葵中两种黄酮类成分的提取工艺进行优化选择以获得最佳提取工艺条件。

1 仪器与药材。

Agilent 1100 Series 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司，包括在线脱气、四元泵、柱温箱、自动进样器、二极管阵列检测器、Hp—Chemstation）， Agilent 8453紫外—可见分光光度计（美国安捷伦公司）， BP211D电子分析天平（德国赛多利斯），Simplicity 185超纯水系统（美国MILLIPORE公司），SB3200—T超声清洗器（上海必能信有限公司），LG16—W离心机（北京医用离心机厂）。青天葵药材经广西中医学院中药研究所刘寿养副教授鉴定为Nervilia fordii(Hance) Schltr.的全草，干燥、粉碎，过20目筛。鼠李柠檬素对照品、鼠李秦素对照品 (自制, 经UV、IR、MS、NMR 确证结构, 其质量分数均为98% 以上)。水为超纯水，甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯，均经0.45 μm微孔滤膜滤过后使用。

2 方法与结果。

2.1 含量测定方法。

2.1.1 色谱条件。

色谱柱为Inertsil ODS—3 C18柱 （250 mm×4.6 mm, 5 μm）（GlScience.Co.Ltd）；流动相为甲醇— 0.4% 磷酸水溶液（63∶37）；流速1.0 ml·min—1；检测波长368 nm；柱温40 ℃；进样量10 μl。混合对照品溶液与样品溶液的色谱图见图1。　　　2.1.2 对照品溶液的制备精密称定鼠李柠檬素对照品0.40 mg于10 ml 量瓶中, 甲醇溶解并稀释至刻度, 配制成0.04 mg/ml鼠李柠檬素对照溶液;精密称定鼠李秦素对照品5.60 mg于10 ml 量瓶中, 甲醇溶解并稀释至刻度, 配制成0.560 mg/ml鼠李秦素对照溶液。

2.1.3 混合对照品溶液的制备分别取鼠李柠檬素对照溶液和鼠李秦素对照溶液各2 ml混匀，作为混合对照品溶液。

2.1.4 线性关系的考察取鼠李柠檬素对照溶液5.0，7.5，10.0，12.5，15.0，17.5 μl进样分析。以峰面积对进样质量作线性回归, 所得回归方程为Y=1 979.614 56X—10.230 767，r=0.999 91。结果表明鼠李柠檬素在0.2～0.7 μg 与峰面积呈良好的线性关系。取鼠李秦素对照溶液5.0，7.5，10.0，12.5，15.0，17.5 μl 进样分析。以峰面积对进样质量作线性回归, 所得回归方程为Y=1 913.653 65X+32.167 478，r=0.999 92。结果表明鼠李秦素在2.8～9.8 μg 与峰面积呈良好的线性关系。

2.2 青天葵提取方法的选择各取青天葵药材1 g,分别按回流提取法、索氏提取法和超声提取法处理（加75%甲醇20 ml，提取时间1 h，提取1次），以两种黄酮鼠李柠檬素和鼠李秦素的峰面积为指标测定。结果见表1。由表1可知，超声提取方法提取鼠李柠檬素和鼠李秦素效果最好。因此，选择超声提取方式提取化学成分。表1 不同提取方法对指标成分提取效果的比较（略）。