APC基因异常甲基化在上皮性卵巢癌中的检测及临床意义

作者：孙健 卢健 邹冬芳 吴国平。

【摘要】 目的 观察结肠腺瘤性息肉病 (APC) 基因异常甲基化在上皮性卵巢癌中的作用及临床意义。方法 59例上皮性卵巢癌组织原发灶，32例相应的盆、腹腔转移灶，12例癌旁卵巢组织及30例正常卵巢组织，采用甲基化特异性聚合酶链式反应(MSP)法检测APC基因启动子区甲基化状态。结果 上皮性卵巢癌组织原发灶及相应的盆、腹腔转移灶中存在APC基因启动子区异常甲基化，发生率分别为32.2%、40.6%，显著高于正常卵巢组织(P0.01)。12例癌旁卵巢组织中1例检测到APC基因启动子区甲基化，30例正常卵巢组织未检测到。APC基因启动子区甲基化的发生率在临床Ⅰ、Ⅱ期低于Ⅲ、Ⅳ期(P0.05)，在高分化癌中低于低分化癌(P0.05)。结论 APC基因启动子区异常甲基化与上皮性卵巢癌发生密切相关，并可能与上皮性卵巢癌临床分期及分化程度有关。

【关键词】 卵巢癌； APC基因； DNA甲基化。

【Abstract】 Objective To observe the role of promoter hypermethylation of adenomatous polyposis coli (APC) gene in the course of epithelial ovarian carcinoma. Methods Hypermethylation of APC promoter was detected by methylation specific PCP (MSP) in 59 epithelial ovarian cancer primary tissues, 32 metastatic tissues of pelvic and abdomen cavity, 12 adjacent noncancerous ovarian tissues and 30 normal ovarian tissues. Results Hypermethylation of APC promoter was detected in ovarian cancer tissues and metastatic sites,the frequency being 32.2% and 40.6% respectively, which was significantly higher than that in normal ovarian tissues(P0.01).Hypermethylation of APC promoter was detected in 1 out of 12 adjacent noncancerous ovarian tissues,and no hypermethylation was detected in normal ovarian tissues.The frequency of hypermethylation of APC promoter was significantly lower in cancers of stage I and Ⅱ than that in stage Ⅲ and IV (P0.05),and so was that in well differentiated cancers than that in poorly differentiated ones. Conclusion Promoter hypermethylation of APC plays an important role in the course of epithelial ovarian carcinoma, and it is related to clinical stage and histopathological grade in epithelial ovarian carcinoma.

【Key words】 Ovarian carcinoma；APC gene；DNA hypermethylation。

结肠腺瘤性息肉病 (adenomatous polyposis coli，APC) 基因是一种抑癌基因，该基因启动子区CpG岛甲基化可使APC蛋白缺失。近来发现在结直肠癌、乳腺癌、肺癌、子宫内膜癌、食管癌、膀胱癌、胃癌、T淋巴细胞瘤等肿瘤中均有APC基因超甲基化［1］，然而对上皮性卵巢癌中APC基因甲基化相关的系统分析还少见报道。我们以上皮性卵巢癌为对象，用甲基化特异性聚合酶链反应(methylationspecific PCR，MSP)法对APC基因甲基化进行检测，观察APC基因甲基化后对APC mRNA表达的影响，并进一步探讨其临床意义。

1 资料与方法。

1.1 临床资料 59例原发上皮性卵巢癌组织、32例相应的盆、腹腔转移灶、12例癌旁卵巢组织及30例正常卵巢组织取自2001～2006年本院妇科及上海市第一妇幼保健院手术治疗的患者，术前均未经放疗和化疗，术后经病理学诊断及组织学分级皆明确。患者手术后立即取材，置于液氮中速冻后转入—70℃冰箱冻存。59例上皮性卵巢癌患者平均48.2岁(39～68岁)，其中浆液性囊腺癌30例，粘液性囊腺癌l8例，子宫内膜样癌9例，透明细胞癌2例。根据细胞分化程度分为：高分化17例，中分化19例，低分化23例。32例相应的盆、腹腔转移灶取自大网膜20例，子宫直肠窝转移结节9例，肠管浆膜面转移结节2例，侧腹壁浆膜面转移结节l例。非癌卵巢组织12例取自上述Ⅰ、Ⅱ期患者癌旁“正常”卵巢组织。30例正常卵巢组织取自因子宫疾病或卵巢良性病变切除的卵巢组织，患者平均49.5岁(39～59岁)。

1.2 甲基化特异性PCR。

1.2.1 组织DNA提取 常规酚氯仿异戊醇法提取组织DNA，紫外分光光度法检测DNA浓度和纯度。

1.2.2 DNA修饰及纯化 取2 μg DNA，在50 μl反应体系中加入3 mol／L NaOH 5 μl，混匀后75℃ 15 min。加入新鲜配置的20 mmol/L氢醌12.6 μl和4.8 mol／L亚硫酸氢钠320 μl(Sigma公司)，混匀后加入10 μl矿物油，55℃水浴过夜。每个DNA样本中加入1 ml DNA纯化树脂(Promega公司)，混匀后通过纯化柱，再加入2 ml 80％异丙醇溶解树脂。3 mol/L NaOH脱硫，5 mol/L醋酸钠、100%冰乙醇沉淀，75%乙醇吹洗DNA。离心后弃上清液，溶于30 μl TE溶液备用。

1.2.3 甲基化特异PCR反应 反应体系共25 μl，包括样品DNA 2 μl，10×PCR buffer 2.5 μl，引物各0.5 μl，dNTP 2 μl，Taq酶0.2 μl，双蒸水17.3 μl。反应条件：95℃预变性5 min；94℃ 30 s，57℃ 45 s，72℃ 30 s，35个循环；72℃延伸10 min。甲基化反应退火温度57℃，非甲基化反应退火温度54℃。以甲基转移酶SssⅠ处理和未处理的正常人外周血细胞DNA作为阳性对照和阴性对照，以双蒸水作为空白对照。引物序列：甲基化引物：上游引物F5’GGTATATTTTCGAGGGGTACG3’，R5’TTCCCGACCCGCACTCCGC3’，预期产物为90 bp；非甲基化引物：F5’TGTGAGGGTATATTTTTGAGGGGTAT3’，R5’CTTCTCTCTCCACTTCCCAACCCA3’，预期产物为109 bp［2］，由上海生工合成。

1.2.4 电泳 取PCR产物5 μl，应用2％琼脂糖凝胶电泳，实验重复3次。

1.3 荧光定量PCR(FQPCR)检测组织标本APC mRNA表达的影响 为检测组织标本APC mRNA表达的影响，我们用SYBR Green Ⅰ 荧光染料进行了FQPCR：①按Trizol试剂说明提取组织标本总RNA；②引物序列：APCmRNA：F5’GAGACAGAATGGAGGTGCTGC3’。R5’GTAAGATGATTGGAATTATCTTCT3’，预期产物为170 bp［3］； GAPDHmRNA：F5’AACGGATTTGGTCGTATTGGG3’，R5’TTGATTTTGGAGGGATCTCGC3’，预期产物为233 bp，由上海生工合成：③逆转录第一链cDNA合成：取总RNA 10 μl，Oligo(dT) 5 pmols，65℃ 5 min之后插人冰中，加入5×Buffer 4 μl，10 mmol/L dNTPs 2 μl，MMLV逆转录酶100 U，RNase抑制剂20 U，加DEPC水至20 μl，42℃ 1 h；④FQ－PCR反应体系为25 μl，其中包含0.7 μl SYBR Green Ⅰ 染料，Mg2+浓度为3.5 μmol/L，扩增条件为95℃ 5 min,95℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，共50个循环后，72℃延伸7 min，每样本4个复孔，在CFD－3220 DNA Engine Option自动荧光PCR仪上进行反应。

1.4 统计学方法 采用χ2检验及Fisher检验法对甲基化频率进行比较。

2 结果。

2.1 上皮性卵巢癌组织中APC基因启动子区甲基化状态 59例上皮性卵巢癌组织原发灶中19例(32.2%)检测到APC基因启动子区甲基化，32例盆、腹腔转移灶中13例(40.6%)检测到APC基因启动子区甲基化。12例癌旁卵巢组织1例(8.3%)检测到APC基因启动子区甲基化。30例正常卵巢组织未检测到APC基因启动子区甲基化。上皮性卵巢癌组织原发灶及转移灶与正常卵巢组织中APC基因启动子区甲基化率相比差异有统计学意义(P0.01)。盆、腹腔转移灶中APC基因启动子区异常甲基化率高于卵巢癌组织原发灶，但差异无统计学意义(P0.05)，见图1(封2)。

2.2 APC基因启动子区甲基化与上皮性卵巢癌临床病理特征的关系 上皮性卵巢癌组织中APC基因启动子区甲基化的发生率在高分化癌中显著低于低分化癌(P0.05)，在浆液性癌、粘液性癌和内膜样癌之间差异无显著性意义；临床Ⅰ、Ⅱ期显著低于Ⅲ、Ⅳ期(P0.05)，见表1。 表1 上皮性卵巢癌临床病理特征与APC基因启动子区甲基化的关系注：与高分化癌比较，P0.05；与Ⅰ、Ⅱ期相比较，△P0.05。