兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶的功能性表达、纯化及活性鉴定

【摘要】 目的：用原核蛋白表达系统对兔辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶(NRDR)进行功能性表达，并对其活性进行鉴定。方法：从兔肝中克隆出NRDR全长序列，运用Gateway表达系统将其编码区序列构建到表达载体(pDEST 17)上，再转化到大肠杆菌(E.coli)(BL21_AI)中表达出兔NRDR蛋白并鉴定其表达形式；取工程菌裂解上清通过金属离子亲和层析纯化出目的蛋白，再运用反相高效液相色谱法(HPLC)测定该酶的Km值和Vmax值。结果：构建出含兔NRDR编码区(768bp)的表达克隆，转化到BL21_AI中表达出氨基端含6×His标签的重组兔NRDR蛋白，诱导表达4h后目的蛋白可占总蛋白量的414%；经一步亲和层析得到的兔NRDR纯度为972%，比活性提高了64倍；经HPLC测定，该酶对视黄醛的Km值为(455±033)μmol/L，Vmax为(0307±0065)μmol/(min·mg)。结论：应用pDEST 17可在BL21_AI中对兔肝NRDR进行高效的功能性表达。

【关键词】 辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶 表达 纯化 类视黄醇代谢。

［Abstract］Objective: To express the rabbit NADP(H)_dependent retinol dehydrogenase/reductase(NRDR)in prokaryotic expression system functionally, and to identify its enzyme activity.Methods: The total NRDR sequence was cloned from the rabbit liver and the coding region of NRDR was constructed to the Gateway_based expression vector (pDEST 17), which was transformed into the Escherichia coli(E.coli)(BL21_AI)for the protein expression. After sonication and centrifugation of the bacteria, the soluble NRDR in supernatant was purified by affinity chromatography. Furthermore, the kinetic parameters of NRDR were determined by high performance liquid chromatography(HPLC).Results: The expression vector with the desired gene(768 bp)was constructed, and then, the NRDR protein, which was harvested at the optimal time point(4 hours after induction), was successfully expressed with a 414% expression level. Moreover, the homogeneous enzyme was obtained by a one_step affinity chromatography, with purity up to 972% and specific activity 64 fold enhanced. The values of the Km and the Vmax were(455±033)μmol/L and(0307±0065)μmol/(min·mg), respectively. Conclusion: The functional rabbit NRDR can be expressed effectively in BL21_AI by pDEST 17.

［Key Words］NADP(H)_dependent retinol dehydrogenase/reductase；expression；purification；retinoids metabolism。

维甲酸是脊椎动物体内重要的生理活性物质，通过调节基因的转录参与细胞生长、形态发生、细胞分化、免疫功能调节等生理过程［1,2］。维甲酸在体内是由视黄醇(维生素A)经两步代谢而成，中间代谢产物为视黄醛，即视黄醇视黄醛视黄酸。辅酶Ⅱ依赖性视黄醇脱氢/还原酶［NADP(H)_dependent retinol dehydrogenase/reductase，NRDR］是从兔肝中发现并纯化的一种酶，具有很强的视黄醇氧化与视黄醛还原活性［3］。视黄醇与视黄醛之间的转化反应是体内维甲酸合成的限速步骤，因此NRDR在调节生物体内维甲酸的稳态过程中起着重要作用［4,5］。由于直接在肝中提纯该酶步骤相对较为复杂，而且提纯过程中目的蛋白易于变性并失去酶活性，从而对该酶的深入研究造成一定困难。本研究拟采用大肠杆菌(E.coli)表达系统对NRDR进行表达、纯化及功能鉴定，为其进一步研究打下基础。

1材料与方法。

11 材料。

111动物。

新西兰大白兔(汕头大学医学院实验动物中心提供)。

112主要试剂AMV逆转录酶(TaKaRa公司，日本)；Trizol试剂、Pfx高保真DNA聚合酶和应用Gateway技术的E.coli蛋白质表达系统(Invitrogen公司，美国)；胶回收试剂盒(上海华舜公司，中国)；质粒提取试剂盒(Qiagen公司，德国)；SuperSignal West HisProbeTM试剂盒(Pierce公司，美国)；镍琼脂糖凝胶(Ni2+ Agarose)(Amersham公司，瑞典)；还原型辅酶Ⅱ(NADPH)、全反式视黄醇、全反式视黄醛、咪唑(Sigma公司，美国)；HPLC级甲醇、乙腈(Fisher公司，美国)；其他为进口或国产分析纯试剂。

12方法。

121PCR引物4对引物见表1。表1PCR引物。

122兔NRDR编码区cDNA克隆及全长扩增 经耳静脉空气栓塞将兔处死后取肝，匀浆处理后以Trizol试剂提取兔肝总RNA，在DU650紫外分光光度计(Beckman公司，美国)上测定OD260/280以确定纯度和含量。取约1μg总RNA，以Oligo dT(15)为引物，在AMV酶作用下于42℃反应60min，逆转录生成cDNA，冰浴终止反应。根据兔NRDR全长序列(GeneBank登录号：AB045133)设计引物S1和R1，以cDNA为模板进行PCR扩增：94℃2min；94℃30s，50℃30s，68℃1min，35个循环；68℃5min。

123表达载体构建设计出编码区带attB重组位点的修饰引物，因其较长，需采用接头PCR(Adapter PCR)法进行扩增。第一轮以NRDR全长扩增序列为模板，S2、R2为引物进行PCR扩增:94℃2min；94℃30s，55℃1min，68℃1min，30个循环；68℃5min。以此PCR产物为模板，S3、R3为引物进行下一轮PCR扩增：95℃2min；94℃20s，55℃30s，68℃1min，9个循环；68℃5min。以第2次PCR产物为模板，S3、R3为引物进行第3轮PCR扩增：95℃2min；94℃20s，45℃30s，68℃1min，8个循环；94℃20s，55℃30s，68℃1min，22个循环；68℃5min。回收扩增片断，按Gateway表达系统说明配置反应液，室温孵育过夜进行BP重组反应，将NRDR编码区构建到供体载体pDONRTM201中，形成Gateway系统入门克隆，并转化至E.coli DH5α，筛选出阳性克隆，扩大培养后提取质粒送广州英骏公司测序确认，引物为P1、P2。将入门克隆与Gateway表达系统的pDEST 17(氨基端带6×His标签)进行LR重组反应，反应产物转化至DH5α，接种于LB固体选择性培养基(含氨苄霉素100 μg/mL)倒置培养过夜。挑取过夜培养的单菌落以S2、R2为引物进行菌落PCR筛选，并选出阳性菌株，扩大培养后提取质粒，转化至BL21_AITM，以S2、R2为引物进行菌落PCR筛选，并选出阳性菌株，此菌株即为ORDR于Gateway系统的原核表达菌株。

124兔NRDR在BL21_AI中的表达用含100μg/mL氨苄西林的LB培养液对表达菌株进行培养(温度37℃，转速230r/min)，在细菌达到对数生长期(OD600≈04)时加入L_阿拉伯糖作为诱导剂，每隔1h取样，连续取样4次。将不同培养时间产物进行十二烷基磺酸钠_聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS_PAGE)分析确定最佳蛋白表达时间。细菌诱导培养至最佳表达时间后，以4 000g离心10min后收集菌体，以25mmol/L、pH74 PBS重悬，并洗涤2次，再次重悬后加溶菌酶至100μg/mL，冰上孵育30min，于400W下超声裂菌，每超声10s间隔10s，共15～20次。裂解液于4℃以15000g离心10min，分别取上清液及沉淀物进行SDS_PAGE分析和活性测定，确认蛋白表达形式。通过HisProbeTM_HRP对表达蛋白进行Western blot测定，进一步确定蛋白表达及其分布比例，采用BandScan及Quantity One软件进行分析。

125表达蛋白活性的测定及纯化在冰上配置反应体系：25mmol/L PBS 440μL，30μmol/L NADPH 5μL，细菌裂解液上清50μL。37℃预热3min，加入30mmol/L溶于二甲基亚砜的视黄醛5μL，于37℃以200r/min振荡孵育10min，加入同体积反应终止液(甲醇/正丁醇＝95/5，含100μg/mL二叔丁对甲酚(BHT)终止反应。充分混合后10000g离心1min，分离出有机相(上清液)。取有机相20μL进行高效液相色谱法(High performance liquid chromatography, HPLC)分析，应用C18反相色谱柱，以乙腈(85%)和30mmol/L乙酸胺(15%)混合液为流动相、流速15mL/min、检测波长325nm，分析确定视黄醇的生成量。应用Ni2+亲和层析技术对重组兔NRDR进行纯化。取15mL Ni2+Agarose装柱，将细菌裂解液上清30mL过柱，以平衡缓冲液(20mmol/LpH74的磷酸纳缓冲液，含05mol/L NaCl及10mmol/L咪唑)平衡约10个柱体积后分别以含250、500mmol/L咪唑的洗脱缓冲液(20mmol/LpH74的磷酸纳缓冲液，含05mmol/L的NaCl)进行洗脱(体积3～4个柱体积，流速1mL/min)。取流出液进行蛋白定量、活性测定、SDS_PAGE分析。