肾肿瘤中浸润性树突状细胞的免疫状态变化
作者：闫东，王勤章，张国玺，倪 钊，李应龙，王新敏，谢顺明，王江平，杨安强，丁国富。
【摘要】 目的 通过分析肾肿瘤中浸润性树突状细胞的免疫状态变化，以探讨其在肾肿瘤微环境中的功能状态。方法 选择未经任何非手术治疗的肾透明细胞癌患者标本40例作为实验组，10例正常肾组织作为对照组，通过免疫组织化学技术标记组织中树突状细胞(dendritic cell, DC)的CD1a、HLA—DR和CD86抗原，观察正常肾及肾透明细胞癌组织中DC的3种抗原的表达，结果进行统计学分析。结果 所有肾透明细胞癌组织中均未见明显CD86+ DC，但均有CD1a+ DC，其在肾癌组织中的浸润程度明显高于正常肾组织(P0.001)，但CD1a+ DC与肾癌临床分期及组织学分级均无相关性；在肾癌组中有34例癌实质内的DC表达HLA—DR抗原，其阳性表达率为85%，与正常肾组织80%的阳性表达率相比无统计学意义(P0.05)。结论 DC具有趋化性，可以向肿瘤组织聚集，肾癌组织中存在CD1a，肾癌患者CD86表达低下，提示肾癌患者DC存在免疫缺陷，而DC的免疫功能低下则可能是肾癌逃避宿主免疫监视的主要原因。
树突状细胞(dendritic cell, DC)是目前已知功能最强的抗原提呈细胞(antigen—presenting cell, APC)，能诱导针对肿瘤相关抗原的特异性T淋巴细胞反应，DC最大的特点是能够显著刺激初始型T细胞(naive T cells)增殖，其抗原提呈能力是其他抗原提呈细胞的10—100倍［1］。诸多的研究证实，DC能在体外摄取肿瘤抗原，并在体内激活初始T淋巴细胞产生抗原特异性，从而在肿瘤免疫中发挥重要的作用。然而，肿瘤宿主本身DC并没有激发机体免疫系统产生有效的抗肿瘤效应，说明肿瘤微环境中的DC，即肿瘤浸润性DC(tumor infiltrating dendritic cell, TIDC)可能存在免疫缺陷，从而导致肿瘤的免疫逃逸。因此研究TIDC有助于揭示肿瘤免疫逃逸的机制。本文采用免疫组化技术，对40例肾癌患者TIDC的免疫状态进行分析，以探讨肾癌中TIDC与肿瘤免疫的关系。
1 材料与方法。
1.1 材料。
1.1.1 标本收集 在新疆石河子大学第一附属医院1990—2006年收治的肾肿瘤患者中，筛选出初发并且未经任何非手术治疗患者的手术切除标本40例，男性26例，女性14例，年龄38—73岁，平均55岁。术后病理证实为肾透明细胞癌作为实验组。组织学分级以往最常用的是1982年Fuhrman四级分类［2—3］。1997年WHO推荐将Fuhrman分级中的Ⅰ、Ⅱ级合并为1级即高分化、Ⅲ级为中分化、Ⅳ级为低分化或未分化。故采用将肾癌分为高分化、中分化、低分化(未分化)的分级标准［4］。分期采用2002年AJCC的TNM分期和临床分期［2］。40例肾透明细胞癌中高分化28例，中分化9例，低分化(未分化)3例；临床Ⅰ期29例，Ⅱ期9例，Ⅲ—Ⅳ期2例。另外,收集该院的正常肾组织标本10例作为对照组。
1.1.2 主要试剂和设备 鼠抗人CD1a(购自中国福州迈新公司)，鼠抗人CD86(购自RDSystems公司，英国)，鼠抗人HLA—DR(购自上海基因公司)。免疫组化成套试剂盒(购自中国福州迈新公司)。
1.2 方法。
1.2.1 标本处理及切片制作 所有标本均经10%(体积分数)中性甲醛溶液固定后，常规石蜡包埋，取4 μm厚的连续切片，置于65 ℃烘箱内烘烤6 h以上备用。
1.2.2 免疫组化染色(S—P法) 按有关试剂的产品说明书进行操作。常规脱蜡至水，滴加过氧化物酶阻断剂10 min后行抗原修复。依次滴加一抗，生物素标记的二抗。每步骤后均用缓冲液(PBS)洗涤5 min，DAB显色，苏木素复染，干燥，中性树胶封片。抗原修复方法：针对CD1a、HLA—DR及CD86采用不同的抗原修复方法。CD1a于二氨四乙酸二钠(ethylenediaminete—traacetic，EDTA)(pH 8.0)修复液，HLA—DR、CD86于枸橼酸缓冲液(pH 6.0)修复液中，微波炉强火3 min左右至煮沸，微波炉低火5 min，连续3次。实验对照：以PBS代替一抗作为阴性对照,以正常肾组织作为阳性对照。
1.2.3 计数方法 由3位病理科主治医师阅片。每张切片任意取DC分布最密集的5个区，在高倍视野下(HPF×400)计数CD1a阳性细胞的数目。以5个高视倍视野下CD1a阳性细胞平均数代表该标本切片中的DC浸润程度。采用成组资料样本均数的t检验统计分析实验组与对照组的CD1a+ DC浸润程度。HLA—DR以细胞膜或胞浆染成黄色、棕色或棕褐色且其染色强度高于背景非特异染色者为阳性细胞；同一阳性片中，不同区域染色强弱不尽相同。按许良中［5］等级评分方法，根据阳性染色强度和阳性细胞所占百分比对HLA—DR表达进行评估。按染色强度评分：无色0分，淡黄色1分，棕黄色2分，棕褐色3分；按染色阳性细胞所占百分比评分：阴性0分，阳性细胞10% 1分，11%—50% 2分，51%—75% 3分，75% 4分。阳性率的确定由经验丰富的病理医生协助进行，两者相乘分值3为阳性，分4等级：—(2分)、+(3—4分)、(5—8分)、(9—12分)。
1.2.4 统计方法 采用SPSS11.5统计软件进行统计学处理。实验结果以均数±标准差表示，原始数据作方差齐性检验后作t检验；多组间比较采用One—Way ANONA分析。