松果菊苷对大鼠脑缺血损伤的保护作用
作者：杜娟，陈虹，姜勇，屠鹏飞。
【摘要】 目的观察松果菊苷（ECH）对大鼠脑缺血损伤海马区神经细胞凋亡的影响。方法雄性SD大鼠，随机分为假手术组、模型组、川芎嗪组、ECH大剂量组、ECH小剂量组。采用大鼠大脑中动脉线栓法（MCAO）建立局灶性脑缺血损伤模型，各组造模后24 h处死，取脑。应用HE染色法观察脑组织病理改变，脱氧核糖核酸末端转移酶介导的缺口末端标记（TUNEL）法观察大鼠脑缺血后海马区神经细胞凋亡。结果脑缺血后，海马区神经细胞正常组织结构消失、胞核碎裂、溶解坏死等形态学改变，凋亡神经细胞数量明显增加；与模型组比较，川芎嗪组、ECH大剂量组和ECH小剂量组海马区凋亡神经细胞表达数量均有不同程度的减少。结论ECH对脑缺血大鼠脑组织具有保护作用，其机制可能与抗细胞凋亡作用有关。
近年来脑缺血损伤与神经元死亡的关系受到广泛关注，而细胞凋亡是神经元死亡的主要方式，研究发现在缺血损伤、兴奋毒性引起的脑损伤中，神经元凋亡明显增加。脑损伤中神经元的凋亡及其发生机制现已成为广泛研究的重点。本文采用大鼠脑缺血模型，观察松果菊苷（Echinacoside,ECH）对脑缺血损伤的保护作用。
1 材料与方法。
1.1 药品与试剂ECH由北京大学药学院屠鹏飞教授惠赠（纯度95%以上），注射用盐酸川芎嗪（哈尔滨三联药业有限公司），红四氯唑（中国华东师范大学化工厂），水合氯醛（天津市福晨化学试剂厂），多聚甲醛（天津市化学试剂研究所），细胞凋亡试剂盒（购自Promega公司），市售鱼线（直径0.26 mm）。
1.2 动物分组及模型制备雄性SD大鼠共50只，体质量250～300 g，购自新疆实验动物研究中心（合格证号：2009—0053）,随机分为5组：①假手术组：生理盐水1 ml·kg—1·d—1×7 d；②模型组：生理盐水1 ml·kg—1·d—1×7 d；③脑缺血+阳性药物对照组：盐酸川芎嗪50 ml·kg—1·d—1×7 d；④脑缺血+ECH大剂量组：ECH 50 mg·kg—1·d—1×7 d；⑤脑缺血+ECH小剂量组：ECH 25 mg·kg—1·d—1×7 d。各组动物每天连续腹腔注射给药7 d，于末次给药1 h后,清醒状态下用10%水合氯醛（3.0～3.5 ml·kg—1）麻醉，采用Longa等［1］提出的改良线栓法法制作大鼠左侧大脑局灶性脑缺血模型(MCAO模型)。假手术组只是鱼线插入仅10 mm，其余步骤同手术组。
1.3 神经功能缺失体征评分按文献［2］的5分制法进行评分。0分：无神经损伤症状；1分：不能完全伸展对侧前爪；2分：向对侧转圈；3分：向对侧倾倒；4分：不能自发行走，意识丧失。1～3分为造模成功动物。0分、4分或死亡剔除，再随机补充。
1.4 TTC染色动物麻醉，取脑—20℃冰箱中速冻20 min，冠状位每隔2 mm切片（5片）。切片置于2%TTC液中，避光放入37℃水浴锅中孵育30 min，4%多聚甲醛固定保存。
1.5 HE染色动物手术后24 h，按文献操作［3］，麻醉，打开胸腔暴露心脏，灌注针插入心尖并剪开右心耳，经左心室插入升主动脉，快速生理盐水灌注至肝脏变白，再持续灌注4%多聚甲醛30 min，至大鼠四肢僵硬。完毕后取脑于上述固定液中4℃固定48 h，常规梯度乙醇脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋制成石蜡切块，在视交叉前后1 mm范围切片，连续冠状切片，切片厚5 μm，HE染色后光镜下观察。
1.6 细胞凋亡采用TUNEL［4］法，按细胞凋亡原位检测试剂盒说明书标记凋亡细胞。具体步骤如下：脑组织切片常规石蜡脱水，滴加TUNEL反应混合物，37℃孵育60 min，滴加转化剂—POD（辣根过氧化酶标记），室温放置15 min，期间用磷酸缓冲液PBS冲洗样本3次，再滴加100 μl的1，2—二甲基苯胺（DAB）底物溶液，室温孵育5～20 min，镜下出现浅棕色背景时，终止反应，苏木素复染。脱水，透明，中性树胶封片，光镜下观察并拍照。
2 结果。
2.1 脑片TTC染色缺血后缺血侧鼠脑肿胀，有明显的梗死灶形成，TTC染色显示正常脑组织呈红色，梗死灶脑组织呈苍白色；所有评分在1～3分大鼠的脑片经TTC染色后均有苍白色梗死灶出现（图1），表明模型的制作是成功的。
2.2 HE染色假手术组可见神经细胞形态完整，排列紧密，胞核完整，核仁清晰，细胞周围间隙无水肿；模型组神经细胞肿胀，多数细胞核固缩，核仁欠清晰。缺血中心区神经细胞正常组织结构消失、胞核碎裂、溶解等坏色形态学改变，坏死灶边缘可见炎性细胞浸润；与模型组比较，川芎嗪组、ECH高、低剂量组神经元细胞数量均有增多，坏死灶周围胶质细胞增生，其中，川芎嗪组合ECH高剂量组肿胀的神经细胞明显减少，胞浆丰富，排列整齐，间质细胞增生，可见形态接近正常的神经元细胞（图2）。