食管鳞状细胞癌中PINCH蛋白的表达及意义
作者：朱振龙，杨艳红，张 钰，王政民，崔冬生，张金廷 王铭维，孙晓峰，Ann Rearden。
【摘要】 目的 探讨PINCH蛋白在食管鳞状细胞癌中的表达及其临床病理意义。方法 采用免疫组化ABC法检测10例正常食管粘膜组织和64例食管鳞状细胞癌组织中PINCH蛋白的表达，并分析其临床意义。结果 PINCH蛋白在鳞癌组织相关间质中呈异质性表达，其阳性率为56.25%（36/64），明显高于正常食管粘膜组织（0/10）（P＜0.05），差异有显著性，而且在肿瘤浸润边缘阳性更明显。PINCH蛋白表达与患者性别、年龄及鳞癌组织学分级无相关性；淋巴结转移组的鳞癌组织中PINCH蛋白阳性表达率为90%（18/20），未转移组鳞癌病例中阳性率为40.91%（18/44），二者相比差异有显著性（P＜0.05）。结论 PINCH蛋白在食管鳞癌中异常表达，可能利于肿瘤的浸润和转移。提示PINCH蛋白可作一个肿瘤相关间质的标志物来预测肿瘤浸润和淋巴结转移的能力。在肿瘤的预后判断上有重要意义，并可能成为与肿瘤间质相关的抗肿瘤治疗的一个新靶点。
【关键词】 PINCH蛋白；鳞癌；食管；免疫组织化学 Expression and Significance of PINCH Protein in Esophagus Squamous Cell Carcinoma。
Key words：PINCH protein; Squamous cell carcinoma; Esophagus; Immunohistochemistry。
在信号传导中，接头蛋白通过蛋白相互反应结构域而发挥作用，其中一个重要的结构域是一种双锌指结构，该结构是LIM（Lin11, Isl1 and Mec3 Proteins）家族的特征[1，2]。PINCH（Particulary interesting new cysteinehisticline rich protein, PINCH ）蛋白是新近发现的LIM家族的一个成员，它在整合素和生长因子信号的传导中起着十分重要的接头联结作用，与肿瘤的发生、发展有一定的关系[3]。Jessica 等[4]应用免疫印迹法和免疫组化法对PINCH蛋白在肺癌、前列腺癌、乳腺癌、大肠癌及皮肤癌中的表达进行了观察研究，发现其与肿瘤的侵袭和转移有关。笔者采用免疫组化ABC法对食管鳞癌组织中PINCH的表达进行检测，并初步探讨其临床病理意义。
1材料与方法。
1.1材料收集河北医科大学第一医院病理科2000年4月～2004年5月间各项临床资料较完整的食管鳞癌手术切除病例64例，其中伴有淋巴结转移者20例。以上标本均经病理证实为食管鳞状细胞癌。同时随机选取手术切除标本断端的正常食管粘膜组织10例作为对照。
1.2临床资料 64例食管鳞癌患者，年龄41～78岁，平均59.5岁；男50例，女14例。依据WHO鳞癌组织学诊断标准进行组织学分级，高、中、低分化各20、39、5例。
1.3试剂与方法 石蜡包埋组织作5μm连续切片，常规HE染色和免疫组织化学ABC法染色。所用兔抗人PINCH蛋白多克隆抗体由Prof. Ann Rearden 惠赠（Department of Pathology, University of California,U.S.A.），二抗、三抗购自福州迈新生物技术开发有限公司。免疫组织化学主要染色过程：①切片脱蜡水化；②3%H2O2甲醇灭活内源性过氧化物酶；③依次滴加一抗、二抗和三抗；④ DAB显色；⑤苏木精复染；⑥常规脱水，透明、封片。用已知阳性的乳腺癌组织作为阳性对照。
1.4染色结果判断 以组织间质中纤维母细胞样细胞的胞膜及胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞。每例随机选出10个不重复、不重叠的高倍镜视野（10×40），计数阳性细胞数及所有细胞数，计算阳性细胞率=∑阳性细胞数/∑细胞数×100%。根据阳性细胞率进行分级，PINCH（），阳性细胞率＜20%；PINCH（+），阳性细胞率20%～50%；PINCH（++），阳性细胞率＞50%。
1.5统计学分析 用χ2 检验进行统计学处理，P＜0.05为差异有显著意义。
2结果。
2.1PINCH蛋白在正常食管粘膜组织中的表达 在10例正常食管粘膜组织中，除1例在上皮层下1/3有灶性阳性表达外，见图1，其余所有被检组织，无论是上皮、还是间质，均无阳性表达。且这1例的阳性表达部位主要在基底层细胞连接处和棘细胞层下1/3的细胞间连接处特别在棘细胞层细胞连接处表达明显，见图2。
2.2PINCH蛋白在食管鳞癌组织中的表达 在64例被检癌组织中，有36例PINCH蛋白在肿瘤间质中阳性表达，见图3。此外，尚发现有少量癌细胞的胞质及胞膜上有PINCH阳性表达，强度较弱，见图4。高倍镜下，阳性表达部位在癌细胞间的细胞间桥上，见图5。在36例间质阳性表达病例中，发现PINCH蛋白的表达呈明显异质性，同一切片不同区域阳性细胞多少不一，分布不均，阳性反应染色深浅不一；特别是其中的13例肿瘤中，在肿瘤浸润的边缘间质组织中PINCH蛋白表达更显著，见图6。
统计学分析表明PINCH蛋白在食管鳞癌间质中的阳性表达率为56.25%（36/64）明显高于正常食管粘膜组织0（0/10），二者差异有显著性（P＜0.05）。
2.3PINCH蛋白表达与患者临床病理特征的关系研究结果显示，PINCH蛋白在食管鳞状细胞癌中的表达与患者性别、年龄及肿瘤的组织学分级无明显相关性（P＞0.05）；但在淋巴结转移组其阳性表达率为90.00%，明显高于淋巴结无转移组40.91%，二者相比差异有显著性（P＜0.05），见表1。表1PINCH蛋白表达与食管鳞癌患者。
3讨论。
PINCH蛋白是一种含有5个LIM结构域的配体蛋白（adaptor protein）蛋白，免疫印迹结果表明其单体相对分子质量为3.7×104[4]。它与整合素一起参与了细胞的粘附作用，调节细胞的形态改变和迁移。然而PINCH并不是直接与整合素相结合，而是借其LIM结构域的第一个双锌指结构与ILK（integrinlinked kinase, ILK）N端的ANK序列相结合，而ILK的C端则与整合素的胞质域相结合，这样它们三者共同形成了信号复合物来参与整合素的信号传导通路[5]。
新近研究发现，PINCH蛋白还参与生长因子信号传导系统，其借助它的LIM结构域的第4个双锌指结构与Nck2相结合。Nck2是一种结合蛋白，它含有SH2/SH3结构域，其中SH3结构域能与胰岛素效应底物1（IRS1）相结合，另外它的C端SH2结构域能识别配体激活的EGF和PDGFβ 受体而参与生长因子信号传导系统[6]。由此可看出，PINCH通过它的第1和第4个LIM结构域而把ILK和Nck2连接起来，参与了整合素和生长因子的信号传导系统，在整合素和生长因子信号传导通路中PINCH蛋白处于一个关键的“十字”交汇点处，相当于一个“三通管”的作用。所以在肿瘤的发生、发展中可能起着十分重要的作用。