热休克蛋白70、 葡萄糖调节蛋白94 和IgG在人肺癌组织中的表达

【摘要】 目的: 探讨热休克蛋白70（Hsp70）、 葡萄糖调节蛋白94（Grp94）、 IgG在人肺癌组织中的表达及意义。方法: 应用免疫组织化学方法结合病理学图像分析系统研究40例肺癌组织中Hsp70、 Grp94和IgG的表达。并用免疫荧光双标染色及激光共聚焦技术研究三者的定位关系。结果: 人肺癌组织中Hsp70、 Grp94、 IgG都有高表达, 阳性率分别为65%(26/40)、 45%(18/40)和82.5% (33/40), Hsp70阳性定位胞核胞质, Grp94和IgG阳性定位主要在胞质, 平均光密度值分别为(5.10±0.32)、 (3.52±0.35)和(8.12±0.31)。26例Hsp70阳性的肺癌病例中有10例与IgG有共定位关系, 18例Grp94与IgG有共定位关系。结论: Hsp70、 Grp94和IgG在肺癌组织中高表达, 提示三者在肺癌的发生发展中起重要作用; 肺癌肿瘤细胞表达的IgG与Hsp70、 Grp94分别存在一定共定位关系, 其在肿瘤的发展中可能具有协同作用或者在肺癌组织中存在Hsp70IgG、 Grp94IgG和Hsp70Grp94IgG复合物的形式。

【关键词】 热休克蛋白70 葡萄糖调节蛋白94 免疫球蛋白G 肺癌 共定位。

热休克蛋白(heat shock proteins, Hsp)是一组高度保守的且具有重要生理功能的蛋白质分子, 在一些应激状态下可被诱导表达。研究表明多种肿瘤细胞都有Hsp70的表达, Hsp70的表达和肿瘤细胞的生长和发展可能存在相关性[1, 2]。内质网分子伴侣Grp94属于Hsp90家族。肿瘤细胞中Grp94的表达增加与细胞的生长存在密切的关系, Grp94的过表达参与了一些肿瘤的形成[3]。IgG是机体免疫系统中的重要分子, 新近的研究发现, 上皮来源的恶性肿瘤如乳腺癌、 大肠癌、 胃癌及体外培养传代细胞等存在Ig或Ig样物质[4]。但是, 目前关于三者在肺癌组织中共表达及相互定位关系的意义报道较少, 本研究通过探讨Hsp70、 Grp94、 IgG在肺癌组织中的表达及相互的定位关系, 为进一步研究肿瘤自身免疫机制和肿瘤的免疫治疗、 肿瘤疫苗开发提供理论基础。

1 材料和方法。

1.1 材料。

肺癌40例组织标本(2005/2006年患者, 男28例, 女12例, 年龄37～76岁, 平均59岁）取自第四军医大学西京医院病理科（临床及病理明确诊断为肺癌的活检组织块）。小鼠抗Grp94单克隆抗体（mAb）、 小鼠抗Hsp70 mAb、 小鼠抗IgG mAb、 HRPIgG二抗（羊抗小鼠)、 兔抗IgG多克隆抗体、 荧光抗体FITCIgG（羊抗兔）、 Texas RedIgG（羊抗小鼠）均为DAKO公司产品。DAB显色试剂盒为Sigma公司产品。

1.2 方法。

1.2.1 免疫组织化学染色。

组织用100 g/L甲醛固定, 石蜡包埋, 做成组织芯片。常规脱蜡至水。组织抗原微波修复10 min。冷却至常温。用10 mL/L过氧化氢室温孵育10 min, 封闭内源性过氧化物酶, 用PBS缓冲液（pH7.4）振洗3次, 每次5 min, 正常羊血清封闭。加一抗(小鼠抗Hsp70 mAb 1∶100, 小鼠抗Grp94 mAb 1∶100, 小鼠抗IgG mAb 1∶100), 37℃孵育1 h, 用PBS液冲洗3次, 每次5 min, 再加HRPIgG二抗（羊抗小鼠), 37℃孵育1 h, 再用PBS液冲洗3次, 每次5 min。经H2O2DAB (5 mL PBS pH7.4, DAB 5 μg, H2O21 mL)在显微镜下控制显色, 苏木素复染套核, 脱水、 透明及封片。以肿瘤细胞中出现棕黄色颗粒者为阳性细胞。

1.2.2 免疫荧光双标记和激光共聚焦显微镜观察。

切片常规脱蜡至水。组织抗原微波修复（柠檬酸盐修复液）。正常羊血清封闭。加一抗(小鼠抗Hsp70 mAb 1∶100, 小鼠抗Grp94 mAb 1∶100, 兔抗IgG多抗1∶100), 37℃孵育1 h, 用PBS液冲洗3次, 每次5 min。再加荧光二抗（羊抗兔FITCIgG 1∶200, 羊抗鼠Texas redIgG 1∶200), 37℃孵育1 h, 再用PBS液冲洗3次, 每次5 min。甘油封片。激光共聚焦显微镜观察并采图。

1.2.3 图像分析及统计学处理 图像采用Imagepro plus5.1分析系统分析。显微镜下每块组织取上下左右中5个显微镜视野采图, 图像分析系统分析每个视野的积分光密度值（IOD）, 然后求平均IOD值。结果采用SPSS11.0统计软件进行统计学处理。

2 结果。

2.1 免疫组织化学染色。

Hsp70、 Grp94、 IgG在肺癌组织中阳性反应产物为棕黄色颗粒。本实验结果显示肺癌组织中Hsp70、 Grp94、 IgG都有高表达。Hsp70阳性率为65%（26/40）, 平均光密度值为5.10±0.32（图1）, 胞核、 胞质都有阳性反应产物（图2）。Grp94阳性率为45%（18/40）, 平均光密度值为3.52±0.35（图1）, 阳性定位主要在胞质（图2）。IgG阳性率为82.5%（33/40）, 平均光密度值为8.12±0.31（图1）, 阳性定位主要在胞质（图2）。

2.2 免疫荧光双标染色及激光共聚焦显微镜观察 镜下明亮的绿色荧光(FITC)显示肺癌组织中IgG, 荧光主要定位在胞质中（图3）; 红色荧光(Texas Red)显示肺癌组织中的Hsp70、 Grp94, Hsp70荧光胞核胞质都有, Grp94荧光主要定位在胞质中（图3）; 黄色荧光显示IgG与Hsp70、 Grp94存在共定位关系（图3）。26例Hsp70染色阳性的肺癌病例中有10例与IgG存在共定位关系, 18例Grp94与IgG存在共定位关系（图3）。

3 讨论。

大量研究表明, Hsp在肿瘤组织中呈高水平表达。本研究发现Hsp70 Grp94 在肺癌组织中也是高表达的。新近研究发现Hsp与肿瘤关系密切, 可与癌基因、 抑癌基因及其产物相互作用调节肿瘤细胞的增殖和异型分化[5, 6]。且Hsp70与原癌基因crnyc、 抑癌基因p53关系密切[7]。Abdel等[8]报道, Hsp70与cmyc蛋白、 p53蛋白的结合抑制了Hsp70与靶分子MHCI类分子的结合, 从而阻止MHCI类分子细胞表面的转运和表达及向NK细胞和T淋巴细胞提呈肿瘤特异性抗原, 这可能是肿瘤细胞的免疫逃逸机制之一。成瘤细胞合成大量的Grp94的能力使其能抵抗具有免疫活性宿主的不利条件而获得成瘤性。有资料显示Grp94与人肺癌的发生发展有关。Grp94表达的升高可能是人肺癌的一个特征[9]。Grp94在肿瘤细胞中作为主要的肿瘤排斥抗原, 引发针对该肿瘤细胞的特异性免疫反应。已证实提取的Hsp70和Grp94具有分子伴侣和免疫佐剂效应, 能够相伴肿瘤抗原肽, 激活免疫细胞特异性攻击肿瘤细胞[10, 11]。抗瘤机制在于其作为伴侣促进抗原肽在MHC I类分子的承载, 因而增强了肿瘤抗原肽在MHC I类分子上的提呈[11]。而且Hsp70或Grp94相伴肽还可以作为超抗原直接激活T淋巴细胞或自然杀伤细胞而不用依赖刺激MHC I类分子[12]。通过这些方式诱导CTL细胞毒反应和激活抗瘤免疫效应。