超声波提取连翘叶总黄酮与总酚酸的实验研究
作者：田粟 唐龙妹 许丽琴 丁月新 刘汝俊 马莉 薛鹏。
【摘要】 目的确定实验室超声波提取连翘叶总黄酮、总酚酸的最佳处理条件。方法采用正交设计法对甲醇浓度（A）、超声时间（B）、提取次数（C）和提取温度（D）4个因素进行考察，确定最优超声提取条件。结果因素D和C对测定指标均有显著性影响，因素A、B为不显著因素。结论以60%甲醇，超声时间10 min/次，提取3次，提取温度45 ℃为最佳超声提取条件。
【关键词】 连翘叶； 总黄酮； 总酚酸； 正交实验； 超声提取。
Abstract：ObjectiveTo ascertain the optimal ultrasonic condition for extraction of total flavonoids and total phenolic acids from Forsythia suspense leaves by orthogonal design. MethodsIn the method of orthogonal test, methanol concentration (60%, 70%, and 80%), ultrasonic time (10 min, 15 min and 20 min), extraction times (1, 2, and 3) and extraction temperature (5 ℃, 25 ℃, and 45 ℃) were analyzed, and the best ultrasonic condition was decided.ResultsExtraction temperature and extraction times had significant effect on either total flavonoids and total phenolic acids contents, methanol concentration and ultrasonic time were unsignificant factors. ConclusionUltrasonic with 20 fold 60% methanol and three times (10 min each time) at 45 ℃ was the optimal condition for extraction of total flavonoids and total phenolic acids from Forsythia suspense leaves.
Key words：Forsythia suspense leaves; Total flavonoids; Total phenolic acids; Orthogonal design; Ultrasonic extraction 连翘Forsythia suspense（Thunb.）Vahl作为传统的中草药，通常是以果实入药，具有清热解毒、消肿散结之功效［1］。在我国的河北和陕西等地，特别是在河北武安县的长寿村，使用连翘叶泡茶饮用是当地人们一直延续至今的生活习惯。朱淑云等［2～4］研究了陕西产连翘叶沸水粗提取物的抗氧化、抗衰老作用。因此有人推测，武安县的长寿现象可能与连翘叶的清除自由基、抗氧化和延缓衰老作用有关。 大量的研究证实多酚类化合物具有良好的清除自由基效果及较强的抗氧化能力［5］。超声波提取因其独特的提取机制及优于常规法的提取效果，在中药化学成分的提取中显示出明显的优势。但是到目前为止，尚未见超声技术应用于提取连翘叶多酚的研究报道。本实验以酚酸及黄酮类化合物为焦点，探讨了不同溶剂对提取连翘叶总黄酮、总酚酸的影响，进而采用正交设计法对甲醇浓度、超声提取时间、提取次数以及提取温度4个因素进行实验，确定了实验室分析连翘叶中抗氧化成分的超声最佳提取条件并测定了总黄酮、总酚酸含量。
1 材料与仪器 连翘叶采摘自河北医科大学校园内，经本校药学院生药教研室鉴定为木犀科植物连翘Forsythia suspense (Thunb.) Vahl的新鲜叶子。实验前拭净叶面，34 ℃干燥24 h，粉碎过筛后（40目）备用。 752N 型紫外可见分光光度仪（上海精密科学仪器有限公司）；KQ3200E型超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。芸香叶苷，即芦丁（SCRC国药集团化学试剂有限公司）；没食子酸（日本和光公司）；其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果。
2.1.1 标准曲线的制备 精密称取干燥至恒重的芦丁对照品20.0 mg， 置10 ml 量瓶中，加甲醇溶解定容，摇匀，得浓度为2 mg /ml的芦丁标准溶液。精确移取芦丁的标准品溶液0.05，0.10，0.15，0.20，0.25，0.30 ml分别置于10 ml量瓶中，用甲醇补足1 ml。加入蒸馏水4 ml，混合放置5 min后，加5% 亚硝酸钠溶液0. 3 ml和10% 氯化铝溶液0. 3 ml，摇匀，放置6 min，加1 mol/L氢氧化钠溶液 2 ml后, 用水定容至10 ml, 充分混合。510 nm处测定吸光度，以吸光度A（Y）与浓度C（X）进行直线回归，得回归方程为Y = 1.096 3X + 0.067 7，r = 0.999 9。在0.01 ～ 0.06 mg /ml线性关系良好。
2.1.2 样品溶液测定精密取适当量的以下所得各样品原液置于10 ml 量瓶中，用甲醇补足1 ml，摇匀，作为供试品溶液。按标准曲线制备项下操作，测定总黄酮含量。
2.2.1 标准曲线的制备 精密称取没食子酸对照品18.8 mg，置100 ml 量瓶中，加甲醇溶解定容，摇匀，得浓度为1 mmol/L的没食子酸标准溶液。精确移取没食子酸的标准品溶液0.015，0.030，0.045，0.060，0.075，0.090 ml分别置于3 ml离心管中，用甲醇补足0.5 ml。加入Folin — Ciocalteu试剂1 ml，混合放置3 min，加7.5% 碳酸钠溶液1 ml，摇匀，放置90 min，10 000 r/min离心10 min，750 nm处测定吸光度，以吸光度A（Y）与浓度C（X）进行直线回归，得回归方程为Y = 16.229X + 0.07，r = 0.999 9。在1.1 × 103 ～ 6.8 × 103 mg/ml内线性关系良好。
2.2.2 样品溶液测定 精密取适当量的以下各样品原液置于3 ml 离心管中，用甲醇补足0.5 ml，摇匀，作为供试品溶液。按标准曲线制备项下操作，测定总酚酸含量。
2.3 提取溶液的选择精密称取连翘叶粉末0.50 g，18份，置于50 ml离心管中，分别加入5 ml石油醚进行脱色脱脂处理，3 000 r/min离心，弃去醚液，重复进行两次后，将滤渣中的石油醚挥发干燥。分别加10 ml沸水、甲醇、乙醇、丙酮、醋酸乙酯、正己烷分3次超声提取，20 min/次， 3 000 r/min离心，收集上清液减压浓缩至干。残渣用适量甲醇溶解，转移至10 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，作为样品原液置于—18 ℃冰箱保存。稀释至适当浓度后，用于测定总黄酮、总酚酸含量。结果见表1。
从不同提取溶剂提取总黄酮、总酚酸含量的测定结果来看，甲醇提取物的总黄酮、总酚酸含量最高，说明甲醇提取连翘叶多酚成分的效果最好，故本研究选择甲醇作为提取溶剂。