藏药寨卡有效部位的分离鉴定及其抗肿瘤活性研究
作者：李艳，江南，罗霞，清源，许晓燕，杨志荣。
【摘要】 目的分离鉴定藏药寨卡的有效部位并对其抗肿瘤活性进行初步研究。方法采用甲醇萃取、酸性氧化铝层析柱层析和谱图分析对寨卡有效部位进行分离提取和鉴定，采用S180荷瘤小鼠模型和CT—26荷瘤小鼠模型，探讨寨卡有效部位提取物的抗肿瘤活性。结果提取分离得到了寨卡中有抗肿瘤活性的有效部位，并经谱图分析鉴定该部位为硫代葡萄糖苷类。经抑瘤实验表明，其能明显抑制S180荷瘤小鼠和CT—26荷瘤小鼠的肿瘤增殖。结论硫代葡萄糖苷是寨卡抑制肿瘤增殖的有效部位，具有一定的抗肿瘤活性。
Abstract:ObjectiveTo extract and identify the active fraction of the seeds of Tibet Medicine Thlaspi arvense Linn. and to study its antitumor activities. MethodsThe active fraction of Thlaspi arvense linn was extracted and identified by nethanol—extraction,tart—Al2O3 colum chromatography,TLC and HPLC.The anti—tumor effect was observed on the mouse model of S180 AND CT—26.ResultsThe active fraction of Thcaspi aruense Linn. was glucosinolate,and it could evidently inhibit the tumor propagation of the two kinds of animal models.ConclusionGlucosinolate is the active fraction of Thlaspi arvense Linn and it has good antitumor effects.
Key words:Thlaspi arvense Linn; Active fraction; Glucosinolate 寨卡是一味常用藏药，为十字花科植物菥蓂Thlaspi arvense Linn.的干燥成熟种子。在传统藏医药应用中，寨卡主要用于治疗目赤肿痛、流泪、肺热、咳嗽、肾热、淋病、消化不良、呕吐等病症。目前，国内外针对寨卡开展的系统研究甚少，仅通过初步的植物化学研究知其含黑芥子苷（Sinigrin）、脂肪油、挥发油、卵磷脂等成分，因此，开展寨卡有效部位分离提取和药效研究，对藏药寨卡的药物开发具有良好的指导作用和应用价值。
十字花科植物已被大量研究证实具有非常突出的抗肿瘤活性，主要原因是其富含抗癌活性成分前体——硫代葡萄糖苷（Glucosinolate）类物质。硫代葡萄糖苷在一些十字花科植物中的含量大约占干重的1%，在一些植物种子中的含量达到10%［1，2］。当十字花科植物因收割、加工、咀嚼等或植物水解而使其细胞破碎时，内源性黑芥子酶释放出来，使硫代葡萄糖苷水解为异硫氰酸盐（isothiocyanates，ITCs）、硫氰酸盐（thiocyanates）和腈（nitriles）而发挥抗肿瘤作用［3，4］。
本实验室在前期已经研究发现寨卡粗提物具有明显的抑制肿瘤增殖活性的作用，且发现等剂量的寨卡粗提物与芥子苷纯品相比，抑瘤活性更强；根据现有资料，本实验室推测寨卡抗肿瘤有效部位可能为硫代葡萄糖苷类物质。在此基础上，本文拟开展对寨卡有效部位进行提取、分离和鉴定的研究，并对有效部位抗肿瘤活性进行验证。
1 仪器与材料。
1.1 仪器。
旋转蒸发仪（上海申顺生物科技有限公司，SENCO R201），层析柱（上海沪西分析仪器厂有限公司，φ25 mm×300 mm），蠕动泵（WATSON MARLOW 504U），HPLC：Waters 1525，Waters 2487，SPD—10AV紫外检测器，AICHROM色谱柱，色谱工作站（天津），凝胶成像系统（BIO—RAD，Gel Doc XR）。
1.2 药材。
寨卡采摘收集自四川省阿坝藏族羌族自治州红原县，经四川省中药研究所中药研究室鉴定为十字花科植物菥蓂Thlaspi arvense Linn.的成熟种籽。
1.3 细胞系和实验动物。
S180（小鼠腹水瘤细胞）,由四川省中药研究所提供；CT—26（小鼠结肠癌细胞，ATCC编号：CRL—2638），购于南京凯基生物科技发展有限公司。昆明种小鼠，清洁级，雌雄各半，18～22 g，由四川省中药研究所动物室提供（川实动质第2002—33号）；BALB/C纯种小鼠，雄性20～25 g，由四川省成都中医药大学动物中心提供。
1.4 药品与试剂。
芥子苷（Sinigrin），购于Sigma公司；酸性氧化铝，购于上海陆都化学试剂厂；甲醇、乙醇、Pb(Ac)2、Ba(Ac)2和KNO3等提取试剂及层析分析试剂均为国产分析纯；色谱试剂均为国产色谱纯。
2 方法与结果。
将寨卡炒香，打粉，过40目筛，得到寨卡粉末。在充分搅拌下，将600 ml甲醇中加热至微沸，缓慢加入200 g寨卡粉末，加料完毕后继续于微沸状态下搅拌20～30 min。待整个体系冷却，将其置于冰浴中使悬浮物完全沉降，收集上清液。固体残渣用600 ml体积分数为70%的甲醇水溶液进行第2次提取，保持微沸状态下搅拌20～30 min，冷却后，将其置于冰浴中使悬浮物完全沉降，收集上清液。合并提取液，加入其体积1/50的Pb(Ac)2—Ba(Ac)2 溶液（0.5 mol/L）沉降提取液中蛋白质。抽滤，滤液于40℃旋蒸浓缩至体积不再减少，以除去大部分甲醇，得棕色硫苷提取液。
将“2.1.1”得到的浓缩提取液转入经蒸馏水平衡的酸性氧化铝柱中进行纯化，先用蒸馏水淋洗以洗净提取液中的有色杂质，再用 1 000 ml 0.1 mol/L KNO3 溶液淋洗，收集KNO3 溶液淋洗的全部洗脱液进行旋转蒸发浓缩，至近干时加入约30 ml的无水乙醇，继续浓缩至干，得到白色固体。将固体样品溶入150 ml甲醇中，达到平衡后滤去不溶物以除去其中的KNO3。滤液继续旋转蒸发至近干，溶于少量无菌水中，于—50℃下冷冻干燥，得到近似白色的固体粉末，即为寨卡有效部位提取物（active fractions of pennycress，ZAF），精密称重，计算得率。
ZAF得率（%）=ZAF重量/寨卡药材重量×100%。
采用硅胶G板为层析板，展开条件为正丁醇∶乙醇∶氨水的比例为5∶1∶2。按比例配制展开剂。将4批次寨卡有效部位提取物（ZAF）点样后进行薄层层析。层析完后在紫外光下显色，并用凝胶成像系统照像记录。
采用HPLC法对寨卡有效部位提取物（ZAF）进行检测，采用峰面积归一化法检验含量。HPLC的试验条件为：色谱柱为AICHROM，(5 μm，4.6 mm×150 mm）；流动相组成为乙腈∶水=20∶80，柱温30℃，流速1.0 ml/min，检测波长为227 nm。数据采集由Waters化学工作站完成。