[纸片协同法检测产金属酶的铜绿假单胞菌] 铜绿假单胞菌严重吗
【摘要】 目的 探讨纸片协同法筛查产金属酶铜绿假单胞菌在临床应用中的实用性。
方法 采用EDTA— Na2和2—巯基丙酸纸片琼脂扩散法来检测金属酶。
结果 64株亚胺培南或头孢他啶耐药的铜绿假单胞菌共检出产金属酶9株，阳性率为14．1%。
结论 纸片协同扩散法是一种简便、敏感的检测产金属酶铜绿假单胞菌的方法，可用于临床常规检测。
� 【关键词】金属酶;铜绿假单胞菌;耐药性 The disk diffusion methods for screening pseudomonas aeruginosa producing metallo—β—lactamase LIAO Kang，HUANG WEI—qiao,CHEN Dong—mei,et al.Department of Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Sun Yat—Sen University,Guangdong 510080,China � 【Abstract】 Objective To investigate the feasibility of the disk diffusion methods for screening Pseudomonas aeruginosa producing metallo—β—lactamase.Methods Metallo—β—lactamases produced by Pseudomonas aeruginosa was detected by using 2—mercaptopropionic acid and EDTA—Na2 in the M—H agar.Results 64 Pseudomonas aeruginosa which resistance for Imipenem acid or Ceftazidime have 9 producing metallo—β—lactamase.The proportion of positive is 14．1%.Conclusion The methodissimple,convenient and sensitive for screening metallo—β—lactamase—producing bacteria.� 【Key words】Metallo—β—lactamases;Pseudomonas aeruginosa;Resistance 铜绿假单胞菌(PA)广泛存在于医院环境中，是引起院内感染的主要病原菌。
随着广谱抗生素的广泛应用，铜绿假单胞菌的耐药菌株逐年增多，近年来一类获得性的能够水解碳青酶烯类抗生素的新的β—内酰胺酶—金属酶(MBLS)的产生，对抗生素的使用造成了更大的威胁。
铜绿假单胞菌中编码耐药金属酶质粒的存在，不仅可造成同种细菌，也可能造成异种细菌之间耐药传播[1]。
传递性耐药质粒耐药产生快，传播广，危害性极大，成为全球共同关注的问题[2]。
本试验采用EDTA—Na2和2—巯基丙酸纸片扩散法来检测铜绿假单胞菌的金属酶，并对其耐药性进行分析。
� 1 材料与方法� 1．1 材料� 1．1．1 菌株来源 中山大学附属第一医院2006年1月至2006年12月临床分离的亚胺培南(IPM)或头孢他啶(CAZ)耐药的铜绿假单胞菌64株。
� 1．1．2 质控菌株 阴性对照菌株ATCC27853 ，购自卫生部临床检验中心；阳性对照菌株IMP—2和VIM—1型的临床分离的铜绿假单胞菌，由浙江医科大学附一院检验科杨青老师惠赠。
� 1．1．3 药敏纸片 英国OXOID公司CAZ(30 μg/片)和IPM(30 μg/片)纸片。
� 1．1．4 化学试剂 500nMEDTA—Na2，购自广东汕头兴宇化工厂(分析纯)；2—巯基丙酸，购自美国Sigma公司。
� 1．2 方法� 1．2．1 细菌培养和鉴定 细菌培养根据临床检验操作规程按常规方法进行，鉴定采用VITEK—60全自动微生物鉴定系统鉴定结果。
� 1．2．2 抗生素敏感试验 采用纸片琼脂扩散法(K—B法)，按美国NCCLS抗微生物敏感性试验M2—A8标准(第十六版信息增刊)判断结果。
� 1．2．3 产金属酶铜绿假单胞菌的检测 参照Arakawa Y等的相关文献[4]并做相应调整后操作如下:在MH平板上涂布受试菌液，两IPM药敏纸片贴于平板上；与一IPM纸片相距1．0~1．5 cm处贴一张含10 μl EDTA—Na2纸片，与另一IPM纸片相距1．5~2．5 cm处贴一张含3 μl 2—巯基丙酸纸片；见图1。
见图2。
35℃孵育18~24 h，若IPM纸片或CAZ纸片靠近2—巯基丙酸纸片或EDTA纸片一侧出现抑菌效果增强或两纸片之间出现协同敏感区，判定受试菌产金属酶。
� 2 结果� 2．1 协同敏感试验 64株测试菌中有9株菌株产金属酶，其阳性率为14．1%。
� 2．2 9株产金属酶的铜绿假单胞菌中有8株与EDTA—Na2出现协同作用，5株与2—巯基丙酸出现协同作用，其中4株既与EDTA—Na2出现协同作用也与2—巯基丙酸出现协同作用，详见表1。
� 2．3 表2结果显示，9株产酶株的耐药谱各不相同，大部分菌株耐药情况十分严重，提示该9株菌可能来源于不同克隆株。
产金属酶菌株对亚胺培南耐药，对头孢他啶、头孢吡肟等临床常用头孢菌素抗生素多数耐药，对环丙沙星、氧氟沙星保持一定的敏感性。
� 3 讨论� 金属酶是一类活性中心依赖金属离子的β—内酰胺酶，主要是Zn2+存在下才有活性，能被EDTA等有机络合剂抑制；因此利用有机络合剂与Zn2+络合从而使金属酶失活导致抑菌圈增大的原理可以检测细菌是否产金属酶[3]。
金属酶能水解所有头孢菌素、青霉素、头霉素，且几乎所有金属酶均可耐受并水解亚胺培南[3]。
而碳青霉烯类抗生素是目前临床上使用的较为有效的抗铜绿假单胞菌药物，金属酶的产生是铜绿假单胞菌对碳青霉烯类抗生素产生耐药的重要机制[5]。
近年来，铜绿假单胞菌耐药现象严重，临床上常用的有效治疗铜绿假单胞菌的抗生素如哌拉西林、头孢他啶、头孢吡肟和亚胺培南等2006年的耐药率分别达到25．3%、18．8%、19．8%和27．3%。
本试验检测出的产金属酶铜绿假单胞菌耐药现象非常严重，9株产酶菌株中有6株对头孢他啶耐药，5株对头孢吡肟耐药，9株均对亚胺培南耐药。
� 国内外文献显示，检测产金属酶菌一般仅采用头孢他啶耐药或仅采用亚胺培南耐药作为初筛条件。
从本试验结果来看，产金属酶的铜绿假单胞菌并不都水解所有头孢菌素，检测出的9株产酶菌株对亚胺培南耐药，7株对头孢他定耐药。
有资料显示，产金属酶和外膜蛋白OprD的缺失是铜绿假单胞菌对亚胺培南耐药的重要机制，并可同时存在 [6]。
外膜蛋白OprD缺失的存在可能对金属酶的检测造成影响，因此，以亚胺培南耐药作为测产金属酶铜绿假单胞菌的初筛条件范围过窄，可能漏掉部分产酶菌株。
同样，单用头孢他定耐药作为初筛条件也可能遗漏。
� 本试验中出现头孢他啶或亚胺培南与EDTA—Na2和2—巯基丙酸均有协同作用或仅与其中一个出现协同作用，这可能与纸片距离、金属酶的基因型表达及金属酶抑制剂的络合效果有关。
研究资料显示，选用EDTA做酶抑制剂时，协同试验的特异性和敏感性可与PCR技术相媲美[4—5]。
本试验结果显示，9株产酶株中与EDTA—Na2出现明显协同作用的有8株，与2—巯基丙酸出现明显协同作用的仅有5株， EDTA—Na2的检出率高于2—巯基丙酸。
这与以上资料的结论较相符。
在结果观察方面，2—巯基丙酸的协同现象比EDTA—Na2更明显，这与有关研究资料表明的2—巯基丙酸络合效果最好，少量也可出现协同现象[4—5]的结论较相符。
� 综上所述，铜绿假单胞菌耐药现象严重，耐药机制复杂，而金属酶的产生对抗生素的使用造成了极大威胁。
因此，检测产金属酶铜绿假单胞菌对临床经验用药及新药开发具有重要意义。
试验结果显示，纸片协同扩散法是一种简便、敏感的检测产金属酶铜绿假单胞菌的方法，可用于临床常规检测。
以亚胺培南或头孢他啶耐药作为检测产金属酶铜绿假单胞菌的初筛条件更全面、更合理。
� 参考文献 ［1］ Poirel,Nass T,Nicolas D.et al.Characterization of VIM—2,a carbapenem—hydrolyzing metallo—isolate in France.Antimicrob Agents Chemotherapy,2000，44:891—897.� ［2］ Poirel L,Lambert 7,Turkoglu S,et al.Characterization of class 1．integrons from Pseudomonas aeruginosa that contain the aminoglycoside resistance gene cassettes.Antimicrob Agents Chemotherapy,2001，45:546—552.� ［3］ 王春新，谢国强，赵琪，等.利用2—巯基丙酸检测产金属β—内酰胺酶细菌.江苏大学学报,2003，13(4):310—312.� ［4］ Arakawa Y,Shibata N,Shibata K,et al.Convenient test for screening metallo—beta—lactamase—producing gramnegtive bacteria by using thiol compounds.J Clin Microbiol,2000,38:40—43.� ［5］ 彭少华，朱琴，顾剑，等.产金属β—内酰胺酶铜绿假单胞菌的基因检测及耐药性研究.中国人兽共患病杂志,2004，20(5):413—416.� ［6］ 王春新，糜祖煌，谢国强，等.铜绿假单胞菌亚胺培南耐药相关性研究.现代实用医学,2003，15(9):543—550.�。