花果山银杏叶中黄酮化合物的提取与测定
作者：胡喜兰 程青芳 尹福军 李静。
【摘要】 目的为适时采收，合理开发利用银杏叶，了解连云港地区银杏叶中主要黄酮含量与摘收季节的关系。方法通过常规的实验方法，水解提取银杏叶中的黄酮，利用HPLC法测定3种不同树龄的银杏叶在春秋两季中主要黄酮化合物含量，同时利用DPPH·法测定其抗氧化活性并加以比较。结果发现不同树龄的银杏叶黄酮含量差异较大，不同生长季节含量存在着差异，春季含量高于秋季；银杏叶提取物的抗氧化活性与黄酮含量基本成正比关系。结论春季采收银杏叶有利于黄酮化合物的开发利用。
银杏叶是银杏科银杏属植物Ginkgo biloba L.的叶子。我国自古以来就认为银杏叶的性味甘、苦、涩、平，归心、肺经。本草纲目中记载银杏具有“敛肺平喘，止遗尿、白带”的功效［1～3］。可用于治疗肺虚咳喘、冠心病、心绞痛、高血脂等症［4,5］。其药用价值日益引起国际医药、化学和植物学界的重视，开始了对银杏叶的综合开发利用和研究。为适时采收合理开发利用银杏叶，了解连云港地区银杏叶中主要黄酮含量与摘收季节的关系，本文通过常规的实验方法，水解提取银杏叶中的黄酮，探索HPLC法的最佳色谱条件，测定3种不同树龄的银杏叶在春秋两季中主要黄酮化合物含量，为进一步研究提供依据。
1 仪器与材料。
紫外分光光度仪：日本岛津公司；B—220型恒温水浴锅：浙江舟山市定海区海源仪器厂；KS—150D型超声波清洗器：宁波科生仪器厂；SHZ—CD 型循环水式多用真空泵：浙江舟山市定海区海源仪器厂；WFZ—2000型紫外可见分光光度计：尼龙柯仪器有限公司；Shimadzu LC—l0A型高效液相色谱仪：日本岛津公司；BS210S 型电子天平（MAX=210g d=0.01mg）：北京塞多利斯天平有限公司；DHG—9240A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；XA—1 型固体粉碎机：金坛市科兴仪器厂；SK—1快速混匀器：常州国华电器有限公司。
样品1： 4月下旬采于淮海工学院多年生银杏树；样品2： 4月下旬采于花果山九龙桥百年银杏树；样品3： 4月下旬采于连云港花果山三元宫千年银杏树；样品4：头年10月下旬采于淮海工学院多年生银杏树；样品5：头年10月下旬采于连云港花果山九龙桥百年银杏树；样品6：头年10月下旬采于连云港花果山三元宫千年银杏树。6种样品叶均于55℃恒温干燥后，粉碎过筛，置于磨口瓶中，密闭避光保存。
槲皮素、山萘酚标准品(中国药品生物制品鉴定所出品)异鼠李素标准品(Biochemika公司)，DPPH·（1,1—二苯—2—苦肼基 1,1—diphenyl—2—picrylhydrazyl ，Sigma 公司），甲醇（色谱纯，国药集团化学试剂有限公司出品）。甲醇、盐酸、磷酸、醋酸等均为分析纯试剂，水为去离子水(自制)。
2 方法。
2.1 黄酮标准品溶液的制备。
2.1.1 山萘酚标准储备液准确称取4.65 mg的山萘酚，加甲醇溶解，完全转移并定容至100.0 ml容量瓶中备用。
2.1.2 槲皮素标准储备液准确称取28.8 mg的槲皮素，加甲醇溶解，完全转移并定容至100.0 ml容量瓶中备用。
2.1.3 异鼠李素标准储备液准确称取5.00 mg的异鼠李素，加甲醇溶解，完全转移并定容至50.0 ml容量瓶中备用。 用时分别精密吸取一定量的上述储备液加甲醇稀释至一定刻度，摇匀即可。
2.2 样品溶液制备分别称取6种样品0.8 g，置于100 ml圆底烧瓶中，加入25 ml甲醇/25%盐酸（4∶1）混合液，闭塞称重，置于水浴中沸腾回流1 h，取出后冷却至室温，称重，以甲醇补足减失重量，过滤后转移至50 ml容量瓶，作为样品溶液1～6号。
2.3 标准溶液最大吸收波长测定分别将槲皮素、山萘酚和异鼠李素标准品及样品溶液用紫外分光光度仪在200～800 nm进行扫描，获得最大吸收波长并加以选择，以防止其他成分干扰。
2.4 最佳色谱条件测定通过对流动相中水和甲醇比值、流速及缓冲溶液的选择等多个方面的改变，获得将槲皮素、山萘酚和异鼠李素分离的最佳条件。
2.5 标准曲线的制作取标准品溶液，在最佳色谱条件下，分别进样2.5，5，10，15，20，30 μl，以峰面积（mV/min）为纵坐标Y，以进样量（μg）为横坐标X，分别作槲皮素、山萘酚和异鼠李素线性回归曲线。
2.6 样品中槲皮素、山萘酚和异鼠李素含量测定和计算取“2.2”制备的样品液（1～6号）1 ml分别稀释于10 ml容量瓶中，在最佳色谱条件下，各进样15 μl，测样品中槲皮素、异鼠李素、山萘酚的峰面积A1，A2，A3，由3者的标准曲线及回归方程，采用外标法，获得进样黄酮量，按下式算出槲皮素、山萘酚和异鼠李素的含量。 C=（X/15×250）/m样品 式中：C—样品中黄酮的含量（mg/g） X—进样溶液中黄酮的量（μg） m样品—样品的质量（g）。
2.7 总黄酮苷含量计算银杏叶中含有30多种黄酮类化合物，主要以糖苷形式存在，直接测定银杏黄酮苷的含量较困难，因为种类太多分离困难、对照品不易得。而这些苷中的苷元主要是槲皮素、山萘酚和异鼠李素，通过其苷元的含量再换算成总黄酮苷含量。槲皮素（quercetin）的分子量是302.2，山萘酚（kaempferol）和异鼠李素（isorhamnetin）的分子量分别是286.24和316.27。据报道，槲皮素鼠李糖—对羟基桂皮酰葡萄糖苷（分子量为756.7）是银杏对心血管系统的主要有效成分，所以被应用作为有效成分含量测定时计算的依据，即黄酮苷与苷元分子量比值取r=756.7/302.2=2.51。