氮源和碳源对冬凌草愈伤组织生长及迷迭香酸的积累的影响
作者：李汉伟，苏秀红，董诚明，王伟丽。
【摘要】 目的研究碳源、氮源对冬凌草愈伤组织生长及其内迷迭香酸积累的影响。方法改变培养基中蔗糖浓度和碳源种类，考察不同碳源及其浓度对愈伤组织生长和迷迭香酸积累的影响。在总氮源不变的情况下改变NO3—/NH4+的比例，考察不同NO3—/NH4+比例对愈伤组织生长和迷迭香酸积累的影响。结果蔗糖是冬凌草愈伤组织培养中的最佳的碳源，其浓度为3%时，有利于冬凌草愈伤组织的生长和迷迭香酸的积累;NO3—/NH4+比例为1∶1时，愈伤增值倍数最高；NO3—/NH4+比例2∶1时，迷迭香酸的积累量最大。结论实验确定了冬凌草愈伤组织培养的最佳碳源种类、浓度及氮源比例,表明不同碳源、氮源对冬凌草愈伤组织生长和次生代谢物合成有显著影响。
【关键词】 冬凌草； 愈伤组织； 碳源； 氮源； 迷迭香酸。
Abstract：ObjectiveTo study the effects of carbon, nitrogen on growth and rosmarinic acid accumulation of Rabdosia rubescens (Henmsl.) Hara callus.MethodsThe callus growth and rosmarinic acid accumulation were studied by manipulation of concentration sucrose, carbon and nitrogen. ResultsSucrose was the best for the callus growth and rosmarinic acid accumulation. 30 g/L sucrose was favorable for callus multiplication and rosmarinic acid accumulated. The maximum callus multiplication, content of accumulated rosmarinic acid were achieved while the ratio of NO3— and NH4+was 1∶1， 2∶1，respectively when concentration of total nitrogen source was kept at the same level. ConclusionVarious carbon, nitrogen have significant effects on growth and rosmarinic acid accumulation of Rabdosia rubescens (Henmsl.) Hara callus. The best carbon source and its concentration,nitrogen sources for the growth of Rabdosia rubescens (Henmsl.) Hara callus and the synthesis of secondary metabolite were confirmed.
Key words： Rabdosia rubescens (Henmsl.) Hara; callus; Carbon; Nitrogen; Rosmarinic acid 冬凌草Rabdosia rubescens (Henmsl.)Hara为唇形科香茶菜属多年生植物,其入药部位是地上部分。近年来许多学者对冬凌草化学成分、药理作用及临床疗效进行了研究，发现其中的主要抗癌、抗菌活性成分为二萜类化合物（冬凌草甲素、冬凌草乙素）和多酚类化合物迷迭香酸，并对其作了较深入的研究［1,2］。国内学者在冬凌草组织培养方面也开展了相关工作［3～5］，但均不够系统和完善，且未对影响其愈伤培养物生长及其内次生代谢产物积累的因素进行研究。迷迭香酸作为冬凌草水溶性部分中主要的有效成分，具有较好的抗菌、消炎、止痛的功效,为此，笔者在本实验室对冬凌草离体培养研究的基础上［6,7］，对影响其愈伤组织生长和代谢产物积累的碳、氮源种类及蔗糖浓度进行了研究，并考察了这些因素对其内主要次生代谢产物－迷迭香酸和冬凌草甲素的影响(因在整个愈伤组织培养过程中未检测到冬凌草甲素,故其积累规律在文中未进行探讨)，为进一步提高冬凌草培养物内有效成分产量、优化培养条件提供依据。
1 材料与方法。
以冬凌草叶片作为外植体，在MS附加6—BA 2.0 mg/L，NAA 1.0 mg/L的培养基上诱导愈伤组织，将诱导出的愈伤组织在上述培养基上，经过3～4代的培养，形成质地较为均匀的愈伤组织。
将继代培养获得的愈伤组织接种到蔗糖浓度为1%，2%，3%，4%，5%的愈伤生长培养基上，每瓶4～6块愈伤组织，每个处理重复8次，并称取接种时的接种量，培养25d后，统计不同蔗糖浓度下愈伤组织的收获量，培养过程中观察愈伤组织的的生长情况。
1.3 碳源处理。
分别以蔗糖、葡萄糖、果糖为碳源，浓度为3％。将继代培养获得的愈伤组织接种于附加6—BA 2.0 mg/L，NAA 1.0 mg/L的MS培养基，每瓶4～6块愈伤组织，每个处理重复8次，并称取接种时的接种量，培养25 d后，称重不同碳源下愈伤组织的收获量，计算愈伤组织的增殖倍数，培养过程中观察愈伤组织在不同碳源上的生长情况。
1.4 氮源处理。
在总氮量不变的情况下，将继代培养获得的愈伤组织接种到改变NO3—/NH4+比例的MS培养基上。每瓶接种4～6块愈伤组织，每个处理重复8次，并称取接种时的接种量，培养25 d后，统计不同氮源下愈伤组织的收获量，培养过程中观察愈伤组织的生长情况。
1.5 迷迭香酸含量的测定。
1.5.1 样品的处理将各个处理的冬凌草愈伤组织，置于烘箱中，80℃烘至恒重，用研钵研成粉末。精密称定粉末0.25 g，置于50 ml的三角瓶中，每次加甲醇20 ml，超声提取30 min，提取两次，合并滤液，回收溶剂，用甲醇溶解残渣，定容于5 ml的容量瓶中，用0.45 μm微孔滤膜过滤，备用。
1.5.2 色谱条件。
日本岛津LC—20A，色谱柱：ODS柱C18（4.6 mm×250 mm），流动相：甲醇—0.5%磷酸水溶液（40∶60），检测波长：335 nm，流速：1.0 ml/min，柱温：25℃。迷迭香酸为Y= 2 447 526.68X－7 443 410.80，r=0.999，迷迭香酸进样量2.55～8.925μg时，线性良好。
2 结果。
2.1 不同蔗糖浓度对冬凌草愈伤组织生长和迷迭香酸积累的影响冬凌草愈伤组织在不同蔗糖浓度上的生长情况见表1。由表1可知，随着蔗糖浓度的增加，愈伤组织的颜色由淡黄绿色变为深绿色，质地由疏松状态逐渐变得较为致密，愈伤增殖倍数也逐渐增加，但当蔗糖浓度为5％时，其增殖倍数有又所降低。从愈伤生长及其增殖来看，以3％、4％蔗糖浓度培养愈伤时其生长情况较好，此时愈伤组织质地较为致密，颜色为翠绿色且未见褐化现象或褐化率较低，愈伤增殖倍数较高，分别为1.58，1.69倍。而从迷迭香酸的积累来看，5％的蔗糖浓度最有利于迷迭香酸的合成，此时其含量最高，为1.52％，其次为3%的蔗糖浓度。2％蔗糖浓度最不利于迷迭香酸的积累，此时其含量最低，为0.68％。综合经济成本、愈伤生长情况、迷迭香酸积累来看，冬凌草愈伤组织培养时以3%的蔗糖浓度为最佳。表1 不同蔗糖浓度对愈伤组织生长和迷迭香酸积累的影响（略）。