利用多重PCR技术检测羊肉中掺杂狐狸肉的方法建设
随着人们生活水平的不断提高，对肉产品的需求量越来越大。
但肉制品掺杂掺假的现象屡见不鲜，掺假的方式包括掺兑、混入、抽取、假冒等手段。
例如一些不法商家或个人为了追求自身利益用低价劣质的肉冒充高价优质的肉，尤以掺杂异种肉（如用鸡肉冒充猪肉，猪肉冒充牛羊肉等）的造假行为最为常见[1]。
2013年5月份，公安部公布的一起食品安全犯罪案件显示，不法商家将未经检验的狐狸、水貂、老鼠等肉品掺杂至羊肉中，销往上海等多地的农贸市场。
这些掺假肉类微生物严重超标，投入市场严重影响了消费者的健康。
目前，对肉类的鉴别方法主要有：显微镜观察法，通过肉制品的味道、色泽、肉类的纹理等进行肉类来源的判别；蛋白质检测法，如等电聚焦电泳法、免疫法、酶联免疫吸附实验（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）、色谱法；DNA检测法，如核酸探针杂交、限制性片段长度多态性聚合酶链反应（Polymerase chain reaction—fragment length polymorphism，PCR—RFLP）分析、DNA 指纹分析和PCR 特异扩增[2]。
基于显微镜及蛋白质的鉴别方法需要丰富的经验，且具有极大的主观性，主要用于生鲜肉类的鉴别。
在熟肉制品中，蛋白质遇高温易变性，利用蛋白质检测法无法灵敏地检测其肉质种源。
除此之外，这些方法存在成本高、工作量大、对检测对象要求高等缺点。
分子生物学鉴定中的DNA杂交法费时、昂贵且复杂，而PCR方法由于反应时间短，具有较高灵敏性、特异性和可鉴别性，已成为肉制品品种鉴别中最常用的方法[2，3]。
目前，根据线粒体基因组DNA序列差异设计物种特异性引物建立的PCR与实时荧光PCR方法已有大量报道，且进入了中国权威的检测技术标准[4，5]。
PCR方法可以解决传统方法中由于蛋白质变性而失能的困难，多重PCR技术具有高效性、系统性和经济简便性的特点，使肉类及其制品种类鉴定成为可能[6]。
本研究根据动物线粒体16S rRNA基因的差异性位点，设计特异性引物，通过优化PCR反应体系，建立了正向引物共用、反向引物特异的PCR反应体系，一次PCR反应可同时扩增出三个不同物种（绵羊、山羊、狐狸）的特异性片段。
该方法具有较高的灵敏度和准确度，且操作简单易行，有望成为常规检测的有效方法。
1材料与方法 1.1试验材料 1.1.1供试材料用于阳性对照的山羊肉和绵羊肉（生肉、熟肉制品）样品及待检测样品购自济南超市及市场，狐狸肉来自蓬莱市新港街道办事处刘家旺村狐狸养殖场。
1.1.2主要试剂和仪器动物组织基因组DNA提取试剂盒（DP304—02，天根）；2Taq PCR Master Mix （TaKaRa），DNA Marker（DL2000，天根）；引物由上海Invitrogen公司合成。
仪器：PCR扩增仪（Veritee96—well，TaKaRa公司）；核酸电泳仪（Power PA 200，Bio—Rad公司）；凝胶成像仪（Alpha Imager EP， Cell Bioscience公司）；台式高速冷冻离心机（5430R，Eppendorf公司）。
1.1.3PCR引物的设计根据山羊、绵羊和狐狸线粒体16S rRNA基因序列（GenBank登录号分别为AB044308.1、HM236185.1、DQ334815.1）设计并确定各自特异引物， 三个物种的编号分别为：山羊—SY、绵羊—MY、狐狸—H，具体信息见表1。
1.2试验方法 1.2.1肉类总DNA的提取使用灭菌打孔器，采用三层五点取样法在山羊肉、绵羊肉、狐狸肉和待检样品的不同部位取样，置于灭菌研钵中剪碎，加入液氮充分研磨。
按照试剂盒说明进行基因组DNA提取。
50 mg样品的总DNA均溶解于100 L TE 缓冲液中，于OD260/OD280测定吸光度值，计算DNA浓度和纯度。
1.2.2PCR反应体系及扩增条件反应体系（25 L）为：rTaq（2.5 U/L）0.15 L，10PCR Buffer 2.5 L，dNTPs（2.5 mmol/L）2.0 L，SYS1 （2 mol/L） 2.0 L、SYA （2 mol/L） 1.5 L、MYA （2 mol/L） 1.0 L、HA （2 mol/L）各2.0 L，模板DNA 1.0 L，ddH2O 12.85 L。
扩增条件为：95℃ 5 min；95℃ 30 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环；72℃延伸10 min，4℃保存。
1.2.3引物特异性试验使用上述反应体系及条件，分别对3种目标肉类和两两等比例混合最终完全混合DNA标本及非目标肉类等材料（牛肉、猪肉、鸡肉、鸭肉、小麦）的DNA标本进行PCR扩增，对山羊、绵羊、狐狸三重PCR引物的特异性进行验证与比较，重复2次。
1.2.4掺杂肉类敏感性试验将山羊、绵羊和狐狸肉的全基因DNA分别用分光光度计将浓度定量到10 ng/L，将山羊肉/狐狸肉、绵羊肉/狐狸肉按照表2的比例进行混匀，参照上述PCR反应体系及反应条件进行扩增检测，重复2次。
2结果与分析 2.1山羊肉、绵羊肉和狐狸肉三重PCR引物特异性试验 PCR结果见图1，山羊肉、绵羊肉和狐狸肉分别得到401、450、300 bp的单一条带，无非特异性杂带；山羊肉/绵羊肉、山羊肉/狐狸肉、绵羊肉/狐狸肉、山羊肉/绵羊肉/狐狸肉的混合DNA扩增条带清晰，能够清楚分辨不同肉类来源的条带；而小麦、牛肉、猪肉、鸡肉、鸭肉及空白对照均没有扩增出条带，说明引物的特异性强。
2.2山羊肉、绵羊肉和狐狸肉三重PCR掺杂肉类敏感性试验 将狐狸肉DNA分别按1%、2%、4%、5%、10%、20%、40%比例与绵羊肉DNA和山羊肉DNA混合，按照上述方法进行PCR扩增并电泳检测扩增效果。
从图2可以看出，在绵羊肉混合狐狸肉检测试验中，该引物对能在山羊肉中特异性地检测出含量高于2%的狐狸肉成分。
从图3可以看出，在山羊肉混合狐狸肉检测试验中，该引物对能在山羊肉中特异性地检测出含量高于20%的狐狸肉成分。
结果显示狐狸肉和绵羊肉掺杂在一起的检测敏感性要比山羊肉和狐狸肉掺杂在一起的检测敏感性高。
3讨论 在动物源性成分鉴定中，多重PCR技术是较为常用的鉴定方法之一。
多重PCR是在同一PCR反应体系里加上两对以上引物，同时扩增出多个核酸片段的PCR反应。
以多重PCR为基础的肉类成分鉴别技术具有检测通量高、仪器设备简单、操作方便且检测费用低的优点，它解决了传统方法中由于蛋白质变性而失能的困难，还可以鉴定肉加工类样品[7，8]。
本试验在参考前人研究的基础上，基于物种间线粒体16S rRNA基因的序列差异，建立了三种肉类成分快速检测的多重PCR方法。