OATPC分子阳离子赖氨酸49突变体削弱其底物摄取能力

作者：杨聪 陈文生 邓国宏 汪荣泉 肖天利。

【摘要】 目的 研究人肝脏特异的有机阴离子转运蛋白基因OATPC分子膜外区保守的49位阳离子赖氨酸，对其有机阴离子底物摄取能力的影响。方法 从人肝脏mRNA中克隆OATPC野生型基因全长cDNA序列，通过定点突变将高度保守的第49位赖氨酸残基突变为中性氨基酸苏氨酸，构建其C端的GFP融合蛋白的真核表达载体，转染HEK293细胞，观察突变体的细胞膜定位能力及底物摄取功能的变化。结果 OATPC野生型及突变体基因均能定位表达于HEK293细胞质膜；［3H］硫酸盐雌酮底物摄取实验显示，突变体5 min底物摄取量较野生型下降74.18%，浓度依赖的［3H］硫酸盐雌酮底物摄取动力学分析表明，突变体Km增高和vmax降低。结论 OATPC蛋白膜外区第49位赖氨酸是其关键的功能氨基酸，是其重要的功能结构单位。

【关键词】 OATPC； 定点突变； 底物摄取； HEK293细胞。

【Abstract】 Objective To investigate the effect of the mutant of organic anion transporting polypeptideC (OATPC) positive ion lysine49 localized on the polypeptide extracellular loop in impairing uptaking ability of its substrate. Methods Full length cDNA of the wild type OATPC was cloned from human liver mRNA by RTPCR. Then, the highly conserved lysine49 residues were mutated to threonine by sitedirected mutagenesis technique to construct the eukaryotic expression vectors of C terminal GFP fusion protein. Targeting ability and its uptaking substrate capability of cell plasma membrane were observed by transfecting those constructs into HEK293 cells. Results Both wildtype OATPC protein and mutant were highly expressed on HEK293 cell plasma membrane. ［3H］ estrone sulfate substrate uptaking technique showed that the amount of substrate uptaken by mutant at 5 min had decreased by 74.18%, compared with the wild type OATPC protein. ［3H］ estrone sulfate substrate uptaking dynamics demonstrated that Km value increased but V max decreased in the mutant. Conclusion The conserved positive ion lysine49 on extracellular loop of OATPC may be a determinant amino acid in uptaking organic anion substrates.

【Key words】 OATPC; Sitedirected mutagenesis; Substrate uptake; HEK293 cell。

OATPC(organic anion transporting polypeptideC)(SLC21A6)是人肝脏中特异性表达的有机阴离子转运多肽， 是OATPs大家族的重要成员。它分布在窦状间隙肝细胞基底侧膜上，参与肝脏摄取多种内源性和外源性有机溶质(如胆红素、某些药物和外源性有机毒素等)。相关研究发现起源于2亿年前的一种古老的海洋鱼类低等脊椎动物——多髦毛小“鳐”的肝脏，存在鼠和人等相似的有机阴离子转运系统，并克隆得到了一个在肝脏组织中特异性高表达的、原始的sOatp基因［1］。进一步对比“鳐”肝脏特异的sOatp和人肝特异性的OATPC分子的高同源性区域，结合其有机阴离子底物转运特性，发现OATPC分子膜外区第49位赖氨酸是高度保守的阳离子氨基酸。推测其与OATPC分子有机阴离子底物摄取功能密切相关，可能是关键的氨基酸基团。为验证此假说，我们从人肝脏mRNA中克隆OATPC全长cDNA序列，通过定点突变将第49位赖氨酸(阳离子氨基酸)突变为中性氨基酸苏氨酸，构建其C端的GFP融合蛋白的真核表达载体，实验观察野生型和突变体的细胞膜定位及底物摄取功能变化，以揭示OATPC转运多肽对有机阴离子底物的选择性转运的分子作用机制。

1 材料与方法。

1.1 材料。

反转录试剂盒、定点突变试剂盒购自Stratagene公司；pcDNA3.1、lipofectamine 2000、mRNA抽提试剂盒Trizol、Topo cloning试剂盒购自Invitrogen公司；放射性底物［3H］硫酸盐雌酮购自PerkinElmer Life Sciences公司；所有抗体(antiOATPC，antiCalnexin)均购自Santa Cruz公司。

1.2 方法。

1.2.1 OATPC基因克隆及其野生型(wide type,Wt)和C端GFP野生融合型基因真核表达载体的构建：用Trizol试剂盒从新鲜人肝组织中抽提分离得到完整的mRNA，反转录为cDNA，设计其特异的Oligo引物ATCTATATTTCAATCATGGACCAAAATC，GACAATGTGTTTCACTATCTGCCCC以及终止密码突变引物TTGGAAACACAGAAGCAGAAGTGGC，经PCR扩增出OATPC全长cDNA(野生型和终止密码突变体)，通过Topo cloning技术自动连接装载入pCR2.1和pcDNAGFP载体，得到pCR2.1OATPC野生型质粒和pcDNAOATPCGFP野生融合型基因真核表达质粒。经DNA序列测定鉴定整个基因序列的正确性后，将OATPC野生型基因从pCR2.1OATPC野生型质粒中酶切后，转装到pcDNA3.1真核表达质粒中，得到不含GFP融合蛋白的pcDNA3.1OATPC野生型真核表达质粒。

1.2.2 对pcDNAOATPCGFP野生融合型基因膜外保守区第49位赖氨酸进行定点突变：用定点突变试剂盒将pcDNAOATPCGFP(Wt)融合基因定点突变；突变体(mutation,Mut)：49 Lys(K)→Thr(T)(AAA→ACA)；突变引物为：5′GACACTAGGTGCAATTATTATGACAAGTTCCATCATTCATATAGAACGG3′。突变后经测序证实成功突变为苏氨酸。

1.2.3 Wt及Mut在HEK293细胞中表达后的细胞定位能力检测：将经多聚赖氨酸处理的2.0 cm×2.0 cm盖玻片放入6孔细胞培养板中，HEK293细胞按3.0×106/孔种植，用含10%胎牛血清的高糖DMEM(Hyclone)培养，待细胞生长铺底约60%时进行转染，将Wt及Mut用脂质体法转染HEK293细胞，转染2 h后经4%多聚甲醛固定,以野生融合型蛋白为阳性对照，共聚焦显微镜下观察OATPCGFP突变体的细胞膜上的定位情况。

1.2.4 Western印迹检测细胞总蛋白和膜蛋白中OATPC和Calnexin蛋白的表达：分别取细胞总蛋白20 μg或膜蛋白100 μg与等体积上样缓冲液混匀，直接上样，蛋白使用7.5% SDSPAGE电泳胶进行电泳分离，然后电转移至硝酸纤维素膜，丽春红染色确定上样的均一性和电转移效率，含1%脱脂奶粉的PBST室温封闭2 h，加一抗(1∶100)室温孵育过夜，用PBST洗去一抗后加入相应二抗(1∶2 000)，室温孵育2 h。OATPC免疫印迹所用的同一硝酸纤维素膜上免疫复合物经洗脱以后，再与另一胞质蛋白Calnexin抗体孵育后，Western印迹检测OATPC和内参照Calnexin蛋白表达量。

1.2.5 Wt和Mut融合蛋白在HEK293细胞对底物［3H］硫酸盐雌酮摄取功能实验：HEK293细胞按2.0×106/孔种植于经多聚赖氨酸铺底处理的12孔细胞培养板中，用含10%胎牛血清的高糖DMEM(Hyclone)培养细胞，待细胞生长铺底约80%～90%时进行脂质体法瞬时转染细胞，在转染24 h后，每孔细胞用DMEM(Hepes，25 mmol/L)1.0 ml漂洗1次，然后每孔加入含1.0 μl［3H］硫酸盐雌酮的DMEM(Hepes，25 mmol/L)200 μl，分别在0、5 min后在0 ℃(冰上)用DMEM(5%BSA，Sigma)400 μl漂洗1次，再用DMEM(Hyclone)400 μl漂洗3次；每孔加入1%SDS 100 μl裂解细胞，取部分细胞裂解液做液闪测定3H放射量，余下的细胞裂解液离心取上清测定蛋白浓度。另外，每孔加入200 μl不同浓度的［3H］硫酸盐雌酮溶液进行浓度依赖摄取实验，5 min后在0 ℃(冰上)DMEM(5%BSA，Sigma)400 μl漂洗1次，再用DMEM(Hyclone)400 μl漂洗3次；每孔加入1%SDS 100μl裂解细胞，取部分细胞裂解液做液闪测定3H放射量，余下的细胞裂解液离心取上清测定蛋白浓度。计算Wt、Mut两种融合蛋白对不同浓度［3H］硫酸盐雌酮的摄取量，运用米式方程作出摄取动力参数图，分别计算出Km值、vmax值。

1.3 统计学分析。

数据用±s的形式表示，用SPSS 10.0统计学分析软件t检验对各组数据进行分析，比较各组间的差异。P0.05为差异有统计学意义。

2 结果。

2.1 Wt和Mut的亚细胞定位。

应用激光共聚焦显微镜在HEK293细胞爬片质粒转染后24 h后观察细胞，细胞核经4′，6二脒基2苯基吲哚染色为蓝色，见图1、2。

图1 野生型激光共聚焦显微镜观察结果。

图2 突变体激光共聚焦显微镜观察结果。

从图1我们可以看出：Wt的绿色荧光主要定位在细胞膜上，在胞质和胞核中的绿色荧光很少，说明了野生型具有在HEK293细胞上有良好的细胞膜定位能力，是能够充分在其胞膜上定位的。这也是发挥OATPC蛋白质摄取功能的基础。而从图2可以看出：Mut的绿色荧光也能够定位在HEK293细胞的胞膜上，但在其胞质中也可见较多的绿色荧光，说明了突变体蛋白在HEK293细胞膜定位能力与野生融合型相比可能有减弱。