MAGE3原核重组表达载体的构建和表达

作者：裴瑞,赵利萍,杨红梅,陈洁,赵国强 毕业论文。

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【摘要】 目的 构建原核重组表达载体pGEX4T1MAGE3并检测其在大肠杆菌（E.coli）BL21中的表达。 方法 RTPCR法制备MAGE3目的基因，采用DNA重组技术将其克隆至pGEMT Easy和亚克隆至pGEX4T1载体，转化E.coli BL21株，经IPTG诱导，12%SDSPAGE电泳分离和Western Blot表达鉴定。结果 扩增出349bp的MAGE3目的基因并构建了原核重组表达载体pGEX4T1 MAGE3；测序结果与GenBank收录序列相一致；在E.coli BL21中检测到含该重组表达载体的转化菌表达出分子量约35kD的融合蛋白并证实其为目的蛋白。结论 成功构建的原核重组表达载体pGEX4T1 MAGE3及其所表达的融合蛋白，为以MAGE3为基础的肽疫苗及特异诊断试剂的研制提供抗原打下了基础，为后续实验提供了依据。 毕业论文。

【关键词】 逆转录聚合酶链反应；黑色素瘤抗原3；克隆表达；重组蛋白。

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黑色素瘤抗原3（melanoma antigen encoding gene3,MAGE3）在肿瘤组织中由于具有广泛而且高比例特异性表达的特性，所以，自其被发现以来就引起了人们极大的兴趣。将MAGE3作为疫苗的免疫疗法是 目前 研究 的热点。研究方向主要集中在MAGE3基因及其编码的蛋白在肿瘤的检测及免疫 治疗 方面。用逆转录聚合酶链反应（RTPCR）法从mRNA水平可以检测肿瘤抗原的表达。但mRNA水平的基因转录并不等于蛋白质水平的表达。而只有肿瘤抗原的表达，才可诱导细胞毒性T淋巴细胞(CTL)对该肿瘤细胞的特异性识别与杀伤。肿瘤抗原与机体免疫应答之间的关系更为密切[1]。MAGE3蛋白抗原在诱发机体抗肿瘤免疫反应及产生特异性杀伤性T淋巴细胞方面具有明确的作用[2]。基于此，我们以pGEX4T1为高效原核表达载体，采用RTPCR法从肝癌组织制备出MAGE3目的基因，成功构建了pGEX4T1MAGE3重组质粒并对此进行了蛋白表达和鉴定。为该抗原蛋白作为肽疫苗和检测诊断试剂用于MAGE3抗原阳性肿瘤的防治提供了条件。 论文代写。

1 材料与方法 论文网。

1.1 实验材料。

肝癌组织标本取自河南省肿瘤 医院 。—80℃保存。pGEMT Easy克隆载体购自Promega公司；pGEX4T1原核表达载体为Pharmacia公司产品。大肠杆菌JM109、大肠杆菌BL21（DE3）由郑州大学基础医学院微免实验室保存。RNA提取试剂盒为Qiagen公司产品； DNA小量纯化试剂盒购自大连宝生物公司；限制性内切酶 BamHⅠ、 EcoRⅠ、 XhoⅡ ，禽源性反转录酶（AMV），dNTP、TaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、Xgal（5溴4氯3吲哚βD半乳糖苷）、IPTG（异丙基硫代βD半乳糖苷）为Promega公司产品；Marker DL2000、琼脂糖购于上海生物工程公司；兔抗MAGE3多克隆抗血清（一抗）：为Santa Ctuz公司产品；碱性磷酸酶标记的抗兔IgG免疫球蛋白（二抗）：购自北京中山生物技术公司；NC膜(硝酸纤维素膜)：购于北京益利精细化学品有限公司，PVDF Westernblot membrane：为BioRad公司产品；ProtEin Marker为TaKaRa公司产品。 论文代写。

1.2 方法 论文网。

1.2.1 MAGE3目的基因的制备 采用RTPCR法，按照QiagenRNA提取试剂盒操作规程，提取总RNA。取其5μl作为模板，在AMV催化下，常规方法反转录出MAGE3 cDNA 。PCR扩增所需引物是根据原核表达载体pGEX4T1和MAGE3基因序列NM005362,用DNAStar软件设计，由上海生工公司合成。

上游引物: P1:5’CAGGATCCATGCCTCTTGAGCAGAGGAGTC3’（210231） 论文网。

下游引物: P2:5’CCGAATTCCCTACTGAGTGCTGCTTGG3’（542524）。

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上述字母下划线处为BamH1、EcoR1的酶切位点。此两位点分别与pGEX4T1上相应的多克隆位点相吻合。PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性60s，55℃退火60s，72℃延伸120s，35个反应循环，最后一个循环72℃延伸300s。取PCR产物5μl 于1.5%琼脂糖凝胶中电泳，DNA Marker2000为标准判断扩增片段。取PCR产物8μl，通过XhoⅡ进行酶切，电泳鉴定。 代写论文。

1.2.2 目的基因与pGEMT Easy及pGEX4T1的重组 大量扩增PCR产物并以1.5%琼脂糖凝胶电泳分离。参照Vitagene DNA凝胶回收试剂盒操作规程加以回收并与pGEMT Easy载体连接。转化感受态E.coli JM109。据氨苄青霉素抗性（Amp+）、蓝白筛选实验，以T7/SP6为克隆鉴定引物进行三次PCR扩增鉴定。PCR扩增条件：94℃预变性3min，94℃变性55s，55℃复性55s，72℃延伸1min，扩增35个循环。最后一个循环72℃延伸300s。抽取每种扩增产物5μl电泳鉴定。将原核表达载体pGEX4T1转化感受态E.coli JM109，培养扩增转化菌。参照Vitagen日常型质粒DNA小量纯化试剂盒操作规程分别提取、纯化pGEMT MAGE3重组质粒和pGEX4T1载体，用BamH1、EcoR I分别酶切，得到MAGE3目的片段和具有粘端的pGEX4T1载体。按照VitageneDNA凝胶回收试剂盒操作规程分别回收目的片段及双粘pGEX4T1载体并将两者连接，转化感受态E.coli BL21，据卡那霉素抗性（Kan+），以T1/T2为特异性引物进行PCR扩增鉴定,条件同上。抽取每种样品及酶切产物各5μl，于1.5%琼脂糖凝胶中电泳。将初步鉴定正确的阳性克隆平板寄送上海生物工程公司进行DNA双向测序，并对测序结果用DNASIS,OMIGA软件与GenBank上公布的MAGE3相应的基因片段进行同源性比较。 代写论文。

1.2.3 目的基因的原核表达及鉴定 将转化有pGEX4T1MAGE3的E.coli BL21在1mmol IPTG诱导下分别培养1、2.5、4、6h。然后将未经IPTG诱导的及经不同时间诱导的各样品进行12%SDSPAGE电泳分离，电转移至NC膜上，再经转印，封闭后，以兔抗MAGE3多克隆抗体（1∶1000稀释）为一抗，碱性磷酸酶标记的抗兔IgG免疫球蛋白（1∶300稀释）为二抗，鉴定原核重组融合蛋白中目的基因片段的表达。 论文代写。

2 结果 论文网。

2.1 目的基因扩增、鉴定 经RTPCR扩增得到349bp的MAGE3目的基因。由于在MAGE3基因386位有Xholl酶切位点，扩增产物经XhoⅡ酶切应该得到185bp和164bp两个片段，实际扩增及酶切结果与 理论 预测完全一致，见图1。

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2.2 重组质粒筛选、鉴定 以T7/SP6为克隆鉴定引物，随机挑选白色菌落进行PCR扩增，并电泳鉴定，得到约525bp的片段。以T1/T2为亚克隆鉴定引物，随机挑选转化菌落进行PCR扩增，鉴定得到4个阳性克隆：pGEX4T1MAGE3。实际结果与预期一致，见图2。

代写论文。