性低O2高CO2对大鼠海马Bcl—2、Bax基因表达和细胞凋亡的影响

【摘要】 目的:探讨慢性低O2高CO2对大鼠海马神经细胞凋亡的诱发作用及对Bcl—2、Bax基因表达的影响。方法:雄性SD大鼠50只，随机均分成5组：正常对照组（NC）、低O2高CO21周组（1HH）、2周组（2HH）、3周组（3HH）和4周组（4HH）。采用TUNEL法检测海马神经细胞凋亡；以RT—PCR检测海马Bcl—2 mRNA和Bax mRNA的表达。结果:随着低O2高CO2时间延长，凋亡指数(AI)及Bax mRNA水平进行性升高；Bcl—2 mRNA先升高后下降（均P0.01）。AI与Bax mRNA之间呈显著正相关（r=0.814，P0.01），而与Bcl—2 mRNA/Bax mRNA比值之间呈显著负相关（r=—0.405，P0.01）。结论:慢性低O2高CO2可以诱发大鼠海马神经细胞凋亡，Bcl—2/Bax比值下降是促进凋亡的重要因素。

【关键词】 海马 低氧 高碳酸血症 凋亡 Bcl—2 Bax。

Abstract: Objective: To explore the inducing effect of chronic hypoxic hypercapnia on the apoptosis of rat neural cells in the hippocampus, and the relationship between the apoptosis and Bcl—2 as well as Bax gene expression. Methods: Fifty male spragu—dawley rats were randomly divided into five groups: normal control group (NC), hypoxic hypercapnia 1—week (1HH), 2—week (2HH), 3—week (3HH) and 4—week (4HH) group. The in situ cell apoptosis in the hippocampus was detected with TUNEL staining. The expression of Bcl—2 and Bax mRNA in the hippocampus were examined with RT—PCR. Results: Apoptosis index (AI) and the expression Bax mRNA were progressirely increased with the prolongation of duration of hypoxic hypercapnic exposure, and the expression of Bcl—2 mRNA was increased at first, then declined. There was a significant positive correlation between AI and the expression of Bax mRNA (r=0.814, P0.01), and there was a significant negative correlation between AI and the ratio of Bcl—2 mRNA/Bax mRNA (r=—0.405, P0.01). Conclusion: Apoptosis can be induced by chronic hypoxic hypercapnia in rat hippocampus. The ratio of Bcl—2/Bax decline accelerates the occurrence of apoptosis.

Key words: hippocampus; hypoxia; hypercapnia; apoptosis; Bcl—2; Bax。

临床上慢性阻塞性肺疾病（chronic obstruc—tive pulmonary disease，COPD）由于通气功能障碍常引起低氧血症或伴高碳酸血症，病情持续发展可导致肺性脑病。动物实验也发现，慢性低氧能够引起脑组织结构和功能的损害[1，2]，但迄今为止，其发生机制尚未完全阐明。近年来研究发现，细胞凋亡可能在慢性低氧性脑损害中起重要作用[3]。本实验采用慢性低O2高CO2性肺动脉高压大鼠模型，通过不同低O2高CO2干预时间（1周、2周、3周、4周），动态观察大鼠海马神经细胞凋亡及凋亡相关基因表达的变化，初步探讨慢性低O2高CO2大鼠海马神经细胞凋亡的可能机制。

1 材料和方法。

1.1 主要材料 常压低02高CO2舱（温州医学院肺心病研究室研制），CYESIl型O2、CO2气体测定仪（上海市嘉定学联仪表厂生产），Medlab生物信号采集处理系统（南京美易科技有限公司生产），TUNEL试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司生产），梯度PCR仪（Effendorf公司生产），RT—PCR试剂盒（Fermentas公司提供）。

1.2 动物分组及模型制备[4] 雄性SD大鼠50只（温州医学院实验动物中心提供），体重180～220 g。随机分成5组：即正常对照组（NC）、低O2高CO21周组（1HH）、2周组（2HH）、3周组（3HH）和4周组（4HH），每组10只。将后4组动物放入常压低O2高CO2舱内，舱内充入氮气（N2）使O2浓度维持在9%～11%，CO2浓度维持在5.5%～6.5%，每天8 h，连续1周（1HH组）、2周（2HH组）、3周（3HH组）或4周（4HH组）。对照组大鼠除吸入空气外，其他饲养条件与各低O2高CO2组相同。动物饲养到规定时间后，用戊巴比妥钠（35 mg/kg）腹腔麻醉，右心导管法测定平均肺动脉压（mPAP）、平均颈动脉压（mCAP）。

1.3 取材和标本制作 经左颈总动脉插管处用4 ℃生理盐水200 m1灌注10 min。将大鼠断头，取脑置于冰盘上，快速分离出左、右海马。左侧海马置于液氮迅速冷冻，再放—70 ℃冰箱保存，用于RT—PCR检测。右侧海马放入4%多聚甲醛中固定4 h，依次进行梯度酒精脱水、二甲苯透明、浸蜡、包埋、5μm厚连续切片，用于细胞凋亡检测。

1.4 海马神经细胞凋亡原位检测 采用原位缺口末端标记（TUNEL）法，按试剂盒提供方法操作。镜检细胞核中有棕黄色颗粒者为凋亡细胞。随机计算5个高倍视野（×400）下的凋亡细胞数。凋亡指数（apoptosis index，AI）以凋亡细胞/100个细胞（%）表示。

1.5 Bcl—2和Bax基因的RT—PCR检测 Bcl—2和Bax引物根据Genebank资料，利用primer 5.0引物设计软件确定最优引物，然后经Blast匹对，由上海生工生物有限公司合成。Bcl—2引物：上游为5‘—CTGGTGGACAACATCGCTCTG—3‘，下游为5‘—GGTCTGCTGACCTCACTTGTG—3‘，扩增片段228 bp；Bax引物：上游为5‘—GCGAATTGGAGATGAACTGG—3‘，下游为5‘—GTGAGCGAGGCGGTGAGGAC—3‘，扩增片段366 bp。以GAPDH作为内参照，引物序列：上游为5‘—AGTATGACTCCACTCACGGCAA—3‘，下游为5‘—TCTCGCTCCTGGAAGATGGT—3‘，扩增片断100 bp。

取左侧海马组织匀浆后，提取1μl RNA样品，采用紫外分光光度法测定RNA纯度，以OD260/OD280的比值表示，要求比值在1.8～2.0之间。取2μg RNA，采用M—MLV逆转录酶，按20μl体系，42 ℃，逆转录1 h。多聚酶反应总体系为20μl（包含GAPDH引物），所有引物退火温度为56 ℃，扩增35个循环，脂糖电泳，溴乙啶染色，紫外灯照相，凝胶图像扫描。

1.6 统计分析 多组样本均数比较进行方差齐性检验，组间比较采用单因素方差分析，方差齐性者用LSD检验，方差不齐者用Dunnett‘s T3检验。双变量相关分析用Pearman直线相关分析法分析。