bax基因对人BcaCD885颊癌细胞凋亡的影响

【摘要】 目的 探讨bax基因对人BcaCD885颊癌细胞凋亡的影响。 方法 转染人baxα基因重组质粒及对照质粒于BcaCD885细胞中。 通过HE染色光镜观察对细胞形态学进行检测； 通过TUNEL原位末端标记及流式细胞术对细胞凋亡进行定性、 定量检测。 结果 bax质粒转染组BcaCD885细胞出现凋亡的形态学改变， TUNEL阳性红染凋亡细胞数量增多， 凋亡小体出现， 其细胞凋亡率与空白对照组及对照质粒转染组之间存在极显著差异(P0.01)。结论 baxα基因重组质粒能促进BcaCD885细胞发生凋亡。

【关键词】 bax基因 BcaCD885细胞 细胞凋亡。

0 引言 　　细胞凋亡在肿瘤发生、发展及治疗中起重要作用，其发生过程受相关基因的调控。与bcl2促细胞存活的作用相反，bax促细胞凋亡。对某一特定的细胞来说，其对凋亡诱因的反应可能取决于bcl2家族成员的表达及相对浓度水平[1]。本研究采用基因转染技术，用Lipofectamin 2000将baxα基因重组质粒pORFhBaxα导入人颊癌细胞株BcaCD885细胞中，提高bax的表达水平，探讨其能否促进癌细胞凋亡。

1 材料与方法。

1.1 材料 　　重组人bax基因表达质粒pORFhBaxα(美国InvivoGen公司):含576bp人baxα基因；对照质粒pORFmcs(美国InvivoGen公司)；RPMI 1640培养基(美国GIBCO BRL公司)；脂质体Lipofectamine 2000（1mg/ml）(美国Invitrogen公司)；TUNEL(Terminal deoxynucleotidyl transferasemediated dUTP nickend labelling technique)原位末端标记试剂盒(德国Boehringer Mannheim公司)；碘化丙啶(Propidium iodide，PI)(美国Sigma公司)。

1.2 方法。

1.2.1 实验分组 空白对照组：BcaCD885细胞培养24h，三蒸水代替质粒“转染”24h，培养24h；对照质粒转染组：BcaCD885细胞培养24h, pORFmcs质粒转染24h,培养24h；bax质粒转染组：BcaCD885细胞培养24h， pORFhBaxα质粒转染24h，培养24h。

1.2.2 细胞培养及转染 BcaCD885细胞于含10%小牛血清的RPMI 1640培养基、37℃ 5% CO2条件下培养。质粒转染采用脂质体Lipofectamine 2000参照产品说明进行。

1.2.3 细胞形态学检测 常规HE染色，光镜观察。

1.2.4 TUNEL原位末端标记细胞凋亡检测 培养细胞弃培养液，4%多聚甲醛固定，40μg/ml的蛋白酶K 37℃消化30min，0.3% TritonX100 (含3％羊血清)通透液4℃处理20min，10% BSA封闭液室温处理30min，TUNEL反应混合液(1液2μl，2液18μl)37℃孵90min，抗荧光素抗体，37℃孵60min，室温下快红显色20min，光镜下观察。细胞核红染为阳性凋亡细胞。以PBS代替TUNEL反应混合液为阴性对照。

1.2.5 流式细胞术细胞凋亡率检测 收获细胞，75%冷乙醇固定，加PI至终浓度为50μg/ml，4℃避光30min，Coulter公司Elite ESP型流式细胞仪检测细胞DNA含量，以G0/G1峰前亚二倍群为凋亡峰，计算凋亡率。

1.3 统计学分析 　　所得数据采用SPSS10.0进行分析。

2 结果。

2.1 HE染色细胞形态学检测结果 　　　　空白对照组及对照质粒转染组BcaCD885细胞密集生长，形态完整，呈圆形、多角形、大小不一，核浆比例倒置，呈恶性改变。bax质粒转染组见大部分细胞核仁消失，核染色致密浓缩，核裂解，胞膜完整，呈现凋亡的形态学改变，见图1～3。

2.2 TUNEL原位末端标记细胞凋亡检测结果 　　空白对照组及对照质粒转染组随机观察5个高倍视野，每高倍视野仅见个别或无凋亡细胞。同法观察bax质粒转染组，每高倍视野见5～8个凋亡细胞，并见凋亡小体出现，见图4～6。