肾病综合征患儿T细胞亚群与激素敏感关系的研究
作者：王惠萍，毛云英，辛芳琴，刘海燕。
［摘 要］ 目的：探讨原发性肾病综合征(INS)患儿外周血T细胞亚群与激素(ＧＣ)治疗效应的关系。方法：按激素疗效的不同将31例INS患儿分为激素敏感组(17例)及激素耐药组(14例)，及20例对照组均于治疗前抽取静脉血分离单个核细胞，加入植物血凝素刺激其生长、传代。48 h~72 h时后取其上清液，用酶联免疫吸附双抗夹心法(ELISA)检测IL4、IFNr。结果：INS中激素敏感组体外PBMCs经PHA刺激产生的IL4水平(195.70±36.61)明显高于激素耐药组(121.17±43.81)及对照组(37.20±12.89)(P0.01)；INS患儿的IFNγ水平明显高于对照组(194.15±30.53)，激素组(606.17±201.03)及激素组(485.64±198.33)之间差异无显著性P0.05。结论：ＮＳ患儿外周血Th2细胞亚群表达升高可能是ＧＣ治疗敏感的原因之一。
原发性肾病综合征(idopathic nephrotic syndromeINS)是以大量蛋白尿、低白蛋白血症、高脂血症和水肿为主要临床特点的常见肾小球疾病。CD4+T细胞依其分泌的细胞因子的类型分为两个亚群Th1和Th2。Th1以产生γ干扰素为特征，Th2以产生IL4为特征。以糖皮质激素治疗INS在国内外广为接受并采纳，但约1/4的INS患者出现激素耐药。Th1/Th2失衡与激素疗效的关系国内无人报道。本文将对INS激素疗效与T细胞亚群之间的关系进行探讨。
1 对象和方法。
1.1 对象。
来自2003年2月至2005年2月间在我院，西安交通大学第一医院、儿童医院、西安市中心医院诊断为INS患儿31例，全部符合小儿2001年11月珠海会议中华儿科肾脏病学组制定的INS诊断标准。男20例，女11例，年龄2岁~15岁。临床表现为单纯性肾病18例，肾炎性肾病13例，分为激素敏感组(17例)及激素耐药组(14例)。激素敏感组：应用激素后，8周内尿蛋白转阴；激素耐药组：应用激素后，8周内尿蛋白未转阴。对照组：20例健康儿童，其中男9例，女11例，年龄2岁~14岁，平均7岁(采血前均未患感染性疾病，未服用过GC和免疫抑制剂)。
1.2 方法。
INS患儿于明确诊断后激素治疗前清晨空腹静脉取血3 ml，快速注入盛有肝素的无菌小瓶中，吸取淋巴细胞分离液(每10 ml稀释血加3 ml~5 ml分离液)或1∶1置于离心管倾斜45度角，将用PBS稀释的血液在距分离层液面上1 cm处沿试管壁缓慢加至分离层上面，将离心管置于水平式离心机内，在18 ℃~20 ℃下，1 500转离心20 min，结束后用直头吸管轻轻插入灰白色层，沿管壁轻轻吸出灰白色的单个核细胞，盛入另一只离心管中，将所得的PBMNC混液用5倍体积的RPMI1640洗涤2次，依次以2 000转/min,5 min，1 500转/min在室温下(18 ℃~25 ℃)离心10 min，可去掉大部分混杂的血小板。在沉淀的PBMNC中加入1 ml 0.83%氯化氨溶液，轻轻震荡20 min，即可裂解红细胞，经1 500转/min，10 min离心洗涤，即可去除红细胞。RPMI1640或PBS洗涤离心3次后，加入10%小牛血清的RPMI1640培养基定容细胞，记数细胞后在调整至所需浓度，一般每毫升血中分离出1×106个单核细胞。用台盼蓝染液检查所分离的细胞活性，记数200个细胞，计算活细胞的百分率，一般活性应在95%以上。将细胞悬液接种于培养瓶中，加入25 μg PHA/ml。将培养瓶放入37 ℃ pH7.2%~7.45%CO2孵箱中培养48 h~72 h后收集上清液，冻存于—20 ℃待测细胞因子。用酶联免疫吸附双抗夹心法(ELISA)检测PBMCs上清液IL4,IFNγ,的含量(进口试剂盒由深圳晶美公司提供)。24 h尿蛋白含量测定采用磺基水杨酸比浊法。