HBV相关性HCC患者癌组织与癌旁组织的蛋白质组差异分析

作者：林英姿，陈仁，杨文,李翠。

【摘要】 　　目的: 应用双向凝胶电泳和质谱技术分析HBV相关性HCC癌组织与非癌肝组织蛋白质组之间的差异，鉴定肝组织蛋白质组中与HBV相关性HCC癌变相关的蛋白. 方法: 收集HBV相关性HCC患者手术切除的癌组织和癌周组织标本，固相pH梯度2DE，凝胶银染、扫描图像、ImageMaster 2DE Elite4.01软件分析差异表达的蛋白质；应用质谱仪得到相应的肽质指纹图谱(PMF)，联网到ExPASY服务器查询相关数据库鉴定获得的差异蛋白质点. 结果: 癌组织、肝硬化组织和慢性肝炎组织平均每张蛋白斑点数为(1281±51), (1188±41)和(1235±31)个，重复性分析发现在等电聚焦（IEF）方向上平均偏差为（2.47±0.25）mm，在垂直板SDSPAGE电泳方向上的平均位置偏差为（2.86±0.31）mm. 47个差异蛋白质点经质谱分析获得28张PMF，初步鉴定了其中的17张PMF. 结论：HBV相关性HCC的癌组织、肝硬化组织、慢性肝炎组织蛋白质组之间存在较明显的差异，鉴定出的差异蛋白质可能有助于研究HBV相关性HCC.

【关键词】 乙型肝炎病毒；肝细胞癌；肝组织；蛋白质组；双向电泳；质谱。

Differential proteomic analysis of hepatic tissues in HBV related hepatocellular carcinoma patients。

【Abstract】 AIM: To explore differential proteome between cancerous tissue and pericancerous tissue in hepatitis B virus (HBV) infection related hepatocellular carcinoma (HCC) using twodimensional polyacrylamide gel electrophoresis (2DE) and matrix associated laser desorption/ionization timeofflight mass spectrometry (MALDITOFMS) and to identify the proteins related to liver carcinogenesis. METHODS: Hepatic tissue specimens were obtained from 18 patients with HCC undergoing partial hepatectomy. Total proteins were separated by immobilized pH gradient (IPG)based 2DE. After silver staining, the gel images were acquired by image scanner and then analyzed with ImageMaster 2DE Elite4.01 software. Peptide mass fingerprint (PMF) of differential protein spots was obtained with MALDTOTMS. Then, the PMF were searched in SWISSPROT/TrEMBL database with the PeptIdent soft. RESULTS: According to 2DE maps, the average numbers of protein spots were (1281±51), (1188±41) and (1235±31) in cancerous, cirrhotic tissues and chronic hepatitis tissues. The average position deviation of matched spots was (2.47±0.25) mm in IEF direction and (2.86±0.31) mm in SDSPAGE direction. Fortyseven differential protein spots were incised from 2DE gels and 28 PMF maps were obtained by MALDITOFMS. The PMF maps were searched in the SWISSPROT/TrEMBL database by PeptIdent software, and 17 proteins were preliminarily identified. CONCLUSION: There are significant proteome differences among chronic hepatitis，cirrhotic and cancerous tissues．The proteins identified in this study may be useful in studies on HBV infection related HCC.

【Keywords】 HBV; hepatocellular carcinoma; hepatic tissue; proteome; 2dimensional polyacrylamide gel electrophoresis; mass spectrometry。

0引言。

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是人类最常见的恶性肿瘤之一，临床流行病学及其他相关研究表明，慢性乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染是HCC的主要致病因素，约有10％～25%的慢性HBV感染患者最终发展为HCC［1］. 癌变组织细胞蛋白质组与非癌变组织细胞蛋白质组差异表达的研究是寻找癌变相关蛋白质、发现肿瘤标记的有效途径［2］. 我们应用双向凝胶电泳和质谱技术，分析HBV相关性HCC癌组织与非癌肝组织蛋白质组之间的差异，鉴定肝组织蛋白质组中与HBV相关性HCC癌变有关的蛋白质.

1材料和方法。

1.1材料人肝癌组织（避开中心坏死区）及癌周2 cm组织18例取自海南医学院附属医院、海南省人民医院2004～2005年间手术切除标本，癌组织符合中国抗癌协会肝癌专业委员会2001—广州会议原发性肝癌临床分期Ⅰ期标准［1—2］；肝硬化标本12例和慢性肝炎组织6例经病理检查证实. 癌患者年龄25～72（平均46）岁，男20例，女4例，无酗酒病史，经血清免疫学标记物和分子生物学标记证实为HBV感染，并经血清抗HCV和HCVRNA检测排除HCV感染. 取得组织后立予4℃生理盐水反复冲洗3次以去除血液，置—80℃冰箱中保存待检.

1.2方法将已处理过的标本从—80℃冰箱中取出，称取癌组织、非癌组织各100 mg置于研磨管，加入组织裂解液1.0 mL，于0℃冰水浴中机械碎裂成匀浆. 常温静置1 h后，再37℃孵育1 h，加痕量DNA酶Ⅰ和RNA酶A去除核酸. 悬液取出后在充分混溶，15 000 r/min，4℃离心1 h. 吸取上清液即为肝组织的总蛋白质，用Bradford法测定蛋白质的浓度. 第一向固相pH梯度等电聚焦. 肝组织总蛋白600 mg与水化液、痕量溴酚蓝混合为350 mL上样液，加入IPGstrip持胶槽中，置入18 cm IPG线性干胶条(pH310L)，在20℃进行等电聚焦，参数设置为：30 V，480 Vh；500 V，500 Vh；1000 V，1000 Vh；3500 V，7000 Vh和8000 V，56 000 Vh. 等电聚焦结束后在平衡液中平衡30 min，在20℃进行第二向SDSPAGE电泳. 用硝酸银溶液银染使凝胶中的蛋白质点可视化. LabScan扫描凝胶成像，ImageMaster 2D软件对癌组织、肝硬化和慢性肝炎组织凝胶进行蛋白质点的差异分析. 当某一蛋白质点在某一类型组织凝胶中表达较其他类型组织凝胶明显增强(校正后蛋白质点的表达量相差3倍以上)，并在不少于50％的该类组织凝胶图谱中表达，视其为差异蛋白质点. 切取凝胶内的目标差异蛋白质点，以铁氰化钾脱色，DTT还原和碘乙酰胺烷基化，TPCK胰蛋白酶酶解，酶解后的肽用三氟乙酸和乙腈溶液萃取两次. 以ZipTipTMC18吸头对样品进行脱盐，制备好的样品用ProFlexTMⅢ MaldiTof质谱仪进行分析：线性模式，正离子谱测定，离子源加速电压1为20 kV，加速电压2为18.85 kV，N2激光波长337 nm，脉冲宽度为3 ns，离子延迟抽取时间为500 ns，飞行管道真空度为4×10—7Torr，质谱信号单次扫描累加50次. 以基质峰和胰蛋白酶自动降解离子峰作为内部标准校正，对肽质量指纹图谱进行校正. 联网ExPaSy 网站，应用PeptIdent软件在SwissProt/TrEMBL database中查询.

2结果。

2.1癌组织与癌旁组织的2DE图谱任意选取20个在癌组织、肝硬化肝组织和慢性肝炎肝组织凝胶图谱中相互匹配、分辨清楚的蛋白质点进行位置重复性分析，发现在等电聚焦（IEF）方向上其平均偏差为（2.47±0.25）mm，在垂直板SDSPAGE电泳方向上的平均位置偏差为（2.86±0.31）mm，表明蛋白质点在位置上具有较好的重复性，此条件基本能满足癌组织与非癌组织之间的蛋白质组差异分析. 在相同的实验条件和参数设置条件下，测得癌组织图谱平均每张蛋白斑点数为（1281±51）个，肝硬化组织图谱平均蛋白斑点数为（1188±41）个，慢性肝炎组织组织图谱平均蛋白斑点数为（1235±31）个. 比较癌组织和癌周组织（肝硬化组织+慢性肝炎组织），在癌组织凝胶中发现14个差异蛋白质点，在癌周组织凝胶中发现差异蛋白质点12个. 其中，肝硬化组织与癌组织比较，在癌组织凝胶中发现19个差异蛋白质点，在肝硬化组织凝胶中发现差异蛋白质点16个；慢性肝炎肝组织和癌组织相比，在癌组织凝胶中发现21个差异蛋白质点，在慢性肝炎组织凝胶中发现差异蛋白质点17个（图1，2）.

2.2癌组织与癌旁组织的2DE图谱差异蛋白质点的肽质量指纹图谱选取上述47个差异蛋白质点进行质谱分析，获得28张PMF，应用PeptIdent软件搜索SWISSPROT／TREMBL数据库，初步鉴定了其中的17张PMF：① 比较癌组织和癌周组织：癌组织凝胶图谱中表达增加的14个差异蛋白质点中（点号01~14），得到11张PMF，有8个蛋白质点得到了鉴定（表1），1个点需进行进一步鉴定，2个点没有匹配数据库中的任何记录. 癌周组织凝胶图谱中表达增加的12个差异蛋白质点中（点号A~L），得到8张PMF，有5个蛋白质点得到了鉴定（表1），2个点需进行进一步鉴定，1个点没有匹配数据库中的任何记录. ②比较癌组织和慢性肝炎组织：癌组织凝胶图谱中表达增强的21个差异蛋白质点（点号01~14, 20~26）中，01~14号差异蛋白质点的鉴定情况见表1，在20~26号7个差异蛋白质点中，得到3张PMF，有2个蛋白质点得到了鉴定（表1中的点22和点24），1个点没有匹配数据库中的任何记录；慢性肝炎肝组织凝胶图谱中表达增强的17个蛋白质点（点号A~L，Q~U）中，A~L号点鉴定情况见表2，Q~U号5个差异蛋白质点中，得到2张PMF，只有1个蛋白质点得到了鉴定（表1中的U号点），另1个点需进一步鉴定. ③比较癌组织和肝硬化肝组织：在癌组织凝胶图谱中表达增强的19个差异蛋白质点（点号01~14，15~19）中，01~14号差异蛋白质点鉴定情况见表1，在15~19号5个差异蛋白质点中，得到2张PMF，1个点需进一步分析鉴定，另1个点的PMF没有匹配数据库中的任何记录；肝硬化肝组织凝胶图谱中表达增强的16个蛋白质点（点号A~L，M~P）中，A~L号点鉴定情况见表2，M~P号4个差异蛋白质点中，得到2张PMF，只有1个蛋白质点得到了鉴定（表1—25中的O号点），有1个点的PMF没有匹配数据库中的任何记录.