南药高良姜基因组DNA提取方法的研究
作者：庞启华，严萍，赵翾，赵树进。
【摘要】 目的提取高质量的高良姜基因组DNA，用于药材分子鉴定、分子系统分类和分子进化等下游分子生物学研究。方法在CTAB改良法基础上，采用4个方案提取DNA。结果用改良CTAB法方案4提取的基因组DNA 的OD260/OD280比值在1.8～2.0之间，产率为0.54～1.049 μg/ mg干燥叶片。基因组DNA能被限制性内切酶EcoRⅠ和Mse Ⅰ完全酶切，经AFLP分析，得到了条带清晰的DNA指纹图谱。结论 用改良CTAB法方案4提取的基因组DNA纯度高，符合分子生物学研究要求。
Abstract:ObjectiveTo develop a method to prepare high quality genomic DNA of A. officinarum Hance for downstream molecubiological research. MethodsFour protocols based on modified CTAB method was performed to extract genomic DNA from A. officinarum Hance. ResultsThe OD260/OD280 ratios of genomic DNA extracted with the fourth protocol of modified CTAB method ranged from 1.8 to 2.0, the yields of DNA sample were in the range of 0.54～1.049 μg/mg dried leaf tissue. DNA samples were completely digested with restriction enzymes ( EcoRⅠ and Mse Ⅰ) and were successfully used for AFLP. ConclusionThe DNA samples extracted with the fourth protocol of modified CTAB method are with high quality and suitable for molecubiological research.
Key words:Alpinia officinarum Hance; Genomic DNA; Extraction 高良姜Alpinia officinarum Hance是姜科山姜属植物，在中国主要分布于广东、海南、台湾、云南和广西(后两省为引种)。高良姜干燥的根茎是著名的十大南药之一，有一千多年药用历史，据《中国药典》记载，高良姜味辛、性热，归脾、胃经，具有温胃散寒、行气止痛和消食的功效［1］，研究表明高良姜还有广泛的药理作用［2］，在香料生产和水果保鲜上也有应用 ［3，4］。长期的采挖和生态环境破坏，导致高良姜野生资源骤减，目前主要通过无性繁殖的方式进行人工栽培。近年来，国际市场对高良姜需求增大，国产高良姜远销中东和欧美，价格呈上升趋势，利益的驱动导致了混淆品和伪品的出现，影响了治疗效果，扰乱了市场，对高良姜的出口造成了负面影响。通过DNA分子标记技术建立高良姜的DNA指纹图谱，以及进行高良姜的分子系统分类、分子进化和遗传多样性研究，可以为高良姜的药材的分子鉴定和质量控制，以及高良姜种质资源保护和开发提供科学依据，而提取高质量的高良姜基因组DNA是进行下一步研究的前提条件。
植物含有丰富的次生代谢物，这些化合物的存在干扰了基因组DNA的提取，不同的植物含有的次生代谢物不一样，基因组DNA的提取方法有所不同，主要有CTAB法和SDS法两种基本方法，并在此基础上进行改良以适合不同的植物［5～7］。本研究根据常规的CTAB法［8］进行改良，比较了4个方案提取高良姜基因组DNA的效果，其中，方案4提取效果较好，DNA纯度和产率较高，可以用于下游的分子生物学研究。
1 材料与方法。
1.1 试剂和溶液CTAB，PVP—40，Tris为Genview分装，β—巯基乙醇、RNAse A为sigma分装，EDTA、氯仿、异戊醇、异丙醇和无水乙醇为国产分析纯，EcoRⅠ和Mse Ⅰ为NEB产品，λHind Ⅲ marker和DL2000 marker为Takara产品。
清洗缓冲液： 200 mmol/LTris—HCl (pH8.0)；50 mmol/L EDTA；250 mmol/L NaCl；2%PVP—40(W/V)。
提取缓冲液A： 2%CTAB (w/v)；100 mmol/L Tris—HCl（pH8.0）；20 mmol/L EDTA（pH8.0）；1.4 mol/L NaCl；2% PVP—40(W/V)。
提取缓冲液B：2%CTAB (w/v)；100 mmol/L Tris—HCl（pH8.0）；20 mmol/L EDTA（pH8.0）；4 mol/L NaCl；2% PVP—40(W/V)。
提取缓冲液C：3%CTAB (w/v)；100 mmol/L Tris—HCl（pH8.0）；20 mmol/L EDTA（pH8.0）；1.4 mol/L NaCl；2% PVP—40(W/V)。
10%CTAB溶液：10%CTAB；0.7 mol/L NaCl。
TE缓冲液：10 mmol/L TrisHCl（pH 8.0）；1 mmol/L EDTA（pH 8.0）以上溶液都经高压灭菌，备用。
1.2 仪器1－15K高速冷冻台式离心机(Sigma)，D/U 530 DNA/Protein Analyzer (Beckman)，Model 200/210 Power Supply (BioRad)，DYCP－31D型水平电泳槽(北京市六一仪器厂)，White/UV Transilluminator凝胶成像仪。
1.3 材料试验材料采自广东的广州、深圳和徐闻、海南万宁、广西南宁、云南西双版纳等地，经过中国科学院华南植物研究所邢福武教授鉴定为植物高良姜（A. officinarum Hance）。
采摘高良姜顶端嫩叶，剪为约2 cm长的小段，放入装有干燥硅胶的密封袋中进行快速干燥，硅胶与叶子的体积比大约为10∶1，硅胶吸水变色时要更换硅胶，干燥叶片保存在密封的塑料袋中置于—20℃保存。
1.4.1 称取50 mg左右的干燥叶片，剪碎后放入研钵中添加液氮研磨成粉末状，迅速转移到2 ml的离心管中。
1.4.2 加入800 μl 65℃预热的CTAB提取缓冲液和20 μl β—巯基乙醇混匀，置65℃水浴1 h（每隔10 min颠倒G1次使溶液混匀），待溶液冷却置室温。
1.4.3 加入等体积的氯仿/异戊醇（24∶1），充分颠倒混匀5 min，12 000 r/min离心10 min，用剪去尖端的1 ml吸头小心吸取DNA水相转入另一2 ml离心管中。
1.4.4 加入0.1体积10%CTAB溶液和等体积的氯仿/异戊醇（24∶1），颠倒混匀， 12 000 r/min离心10 min，吸取DNA水相转入另一2 ml离心管。
1.4.5 重复步骤“1.4.3”，把DNA水相转入1.5 ml的Axygen离心管中。
1.4.6 加入0.6体积预冷的异丙醇，颠倒混匀，置于—20℃放置30 min，沉淀DNA， 6 000 r/min离心10 min，去除上清液。
1.4.7 DNA沉淀先后用1 ml 70%乙醇和90%乙醇浸泡洗涤5 min，6 000 r/min离心10 min，去除上清液。
1.4.8 DNA沉淀在超净工作台中自然风干，用50 μl TE溶解DNA，加入5μl RNAse A（10 mg/ml）于37℃中水浴2 h以上，DNA样品保存于—20℃备用。
1.5.4 方案4在步骤“1.4.1”之后向离心管中加入1 ml清洗缓冲液，混匀并放置5～10 min，8 000 r/min离心10 min，去除上清液，然后步骤“1.4.2”加入取缓冲液A。
1.6 DNA浓度、纯度的测定。
1.6.1 紫外分光光度计检测把DNA溶液稀释20倍，用紫外分光光度计中测定其在230，260和280 nm的OD值，根据OD260/OD280、OD260/OD230判断DNA的纯度，计算DNA的浓度和产率。