cAMP 反应元件结合蛋白磷酸化参与学习记忆过程的分子机制
【关键词】 磷酸化。
磷酸化是细胞信号通路中转录因子活性调控的主要机制。cAMP反应元件结合蛋白（cAMP responsive element binding protein，CREB）是最早证实由磷酸化调控其活性的转录因子之一，在脑内所有细胞中均有表达，定位于核内并在多种信号分子诱导下调控大量下游靶基因的表达。由于在多种细胞及动物模型中证实CREB磷酸化在学习记忆过程中发挥重要的作用，CREB磷酸化成为近年来相关领域的研究热点。
1 CREB家族及其结构特点。
由于剪接位点不同，CREB有CREBδ、CREBα、CREBβ等多种形式，CREBα为编码341个氨基酸残基的蛋白（下文中所指氨基酸残基编号均指CREBα），而CREBδ缺乏14个氨基酸残基α肽的插入，二者在人、大鼠、小鼠中均有表达。CREBβ为剪切删除几个5’外显子形成的缺乏N端40个氨基酸残基的蛋白。3种形式的CREB均可活化cAMP反应元件（cAMP responsive elements，CRE）依赖的转录，其他少见的CREB形式为抑制性CREB，可能为调节活化型CREB形成的重要因素。
CREB的结构域包括：Q1、α、激酶诱导区域（kinase inducible domain，KID）、Q2/CAD、亮氨酸拉链模体（basic leucine zipper motif，bZIP）。bZIP为C末端的高度保守结构，CREB与DNA靶序列cAMP反应元件在此结构域与CREB或其他bZIP超家族成员ATF—1(活化转录因子—1)、cAMP反应元件调节器（cAMP response element modulator，CREM）形成同源或异源二聚体与DNA结合,该结构域的缺失将明显抑制相应靶基因的表达。KID是其另一个高度保守的结构域，包含60个氨基酸残基，多个磷酸化位点分布其中，包括Ser133，是CREB磷酸化的必要结构，甚至在缺乏CREB其他结构域时仍可在多种刺激诱导下活化转录。Q2结构域包含165～252残基，与位于CRE序列下游的TATA盒上的转录因子相互作用，共同参与基础转录调控。Q1为N末端富含谷氨酰胺区域，对CREB转录激活潜能也有一定程度的调节作用。
CREB的活化必须由磷酸化介导，尤其是特殊位点Ser133的磷酸化（Ser133—p）［1］ , Ser133位于KID结构域，该结构域的磷酸化位点还包括Ser142等多个磷酸化位点，Ser133外的其他位点磷酸化可能对CREB活化起抑制作用。CREB可在不同信号通路的激酶作用下实现Ser133磷酸化而活化，其中多种通路已被证实可磷酸化CREB并在学习记忆过程中起重要作用，包括cAMP/cAMP—依赖性蛋白激酶A （cAMP—PKA）、钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶Ⅳ（calcium /calmodulin—dependent protein kinase Ⅳ，CaMKⅣ）、CaM Ⅱ、Ras—ERK—RSK（Ras—胞外信号调节激酶—核糖体S6激酶)等［2—5］。其中研究最为透彻的为cAMP—PKA通路对CREB的磷酸化，膜上的G蛋白耦联受体与胞外递质等配体结合后活化，刺激腺苷酸环化酶（adenylyl cyclases，AC）增加胞内cAMP浓度，4分子cAMP与PKA结构亚基上的位点结合，具有催化活性的PKA调节亚基解离并进入核内，磷酸化CREB从而启动下游靶基因的转录。近期研究证实，在阿尔茨海默病（Alzheimers disease，AD）中存在PKA—CREB信号通路功能障碍，在AD发病中起核心作用的β淀粉样蛋白(amyloid—beta，Aβ)在低浓度即可引起PKA—CREB信号通路功能异常，CREB磷酸化水平下降，引起与学习记忆功能密切相关的海马CA1区长时程增强（long—term potentiation，LTP）被抑制，应用特异性磷酸二酯酶抑制剂咯利普兰(rolipram)干预可恢复cAMP/PKA/CREB 通路活性及LTP［6］。另外，钙相关的钙调素、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen—activated protein kinase，MAPK）等激酶也可类似地增加CREB磷酸化水平。CaM Ⅱ因磷酸化Ser142促使CREB二聚体解离而对CREB介导的基因转录起抑制作用。
CREB可以识别许多靶基因上8个碱基对回文序列的cAMP反应元件,5’—TGACGTCA—3’，调控基因转录，也可与活性较低的基序形式的CRE(5’—CGTCA—3’)结合。CREB可与某些细胞多达千种以上基因启动子结合［7］，但并非所有含有CRE位点的基因均为功能性靶基因。CREB磷酸化调控的基因转录涉及包括在代谢、转录、学习记忆、细胞周期调控、细胞信号、生长繁殖发育等多种生物功能中相关的蛋白、因子、受体的大量的功能性基因，其中包括多种重要的神经肽、神经递质及受体或生长因子、信号分子，如：脑啡肽、神经递质受体亚基GluR1［8］、诱导型一氧化氮合酶（iNOS）、脑源性神经生长因子（brain—derived neurotrophic factor,BDNF）［9］ 、促肾上腺皮质激素释放激素（CRF）、N—乙酰转移酶、囊泡单胺转运体等。CREB磷酸化正是通过改变靶基因的表达影响学习记忆功能。
CREB磷酸化调节大量神经元蛋白基因表达，影响个体神经元直至整个神经网络的功能。应用多种形式的学习记忆检测手段均已证实CREB磷酸化在不同类型的学习记忆中的重要作用，并在海兔、果蝇、啮齿类动物等多种种属动物实验中得到验证［10—12］。现有资料支持CREB磷酸化参与长时程记忆，对瞬间记忆影响不大［13—14］。学习记忆是中枢神经系统对外界信息的摄取、加工处理、巩固等过程，是个体对外界环境的一种适应，由于神经元缺乏再生及分裂能力，这种适应就体现了脑组织的可塑性，后者包括多种机制：长时程增强（LTP）和长时程抑制（LTD）；神经元轴突和树突上突起数量的变化；受体表达和激活过程中突触模式的改变等。CREB磷酸化调节学习记忆功能的具体机制现尚未完全明确，目前认为CREB磷酸化可能通过以下机制参与学习记忆过程。
3.1 CREB磷酸化与LTP、双向突触可塑性 突触传递的长时程增强（long—term potentiation，LTP）的研究始于20多年前的实验发现，当用短串高频电刺激海马的兴奋性传入神经时，海马突触传递可在数秒钟内增强，其增强效果能持续数小时至数周。LTP是哺乳动物中枢神经系统贮存信息的主要机制，是学习记忆的细胞基础，已成为神经元可塑性的一种有效模型。晚期LTP（late phase LTP，L—LTP）可持续数小时到数天，需要基因转录及新的蛋白合成，是长时程记忆的重要机制。越来越多动物实验证明CREB在介导L—LTP及记忆过程中的不可替代的作用。
重组表达活性形式的CREB（constitutively active form of CREB，CREBCA)可降低诱导持续性的L—LTP的阈值［15］。在成年大鼠的培养脑片中，CREB在LTP诱导后的维持期内呈持续的活化状态达4 h，提示CREB磷酸化对L—LTP维持也起非常重要的作用，特异性地阻断核内活化CREB的重要激酶PKA后CREB磷酸化水平下降，而且出现海马CA1区L—LTP障碍［16—17］。另外，新近的证据也支持CREB依赖的转录除增加NMDA受体介导的突触传导外，CREBCA表达还显著增加LTP的幅度与维持时间［18］。不同的蛋白激酶，包括胞外信号调节激酶2（extracellular signal—regulated kinase 2，ERK2)、PKA、CaMKⅣ等，均可通过磷酸化CREB诱导或促进L—LTP，并改善动物的学习记忆功能［18—21］。在表达持续活化的CREB的转基因小鼠（VP16—CREB小鼠）中还发现，活化的CREB可能是通过增加BDNF的表达促进或利于海马L—LTP的诱导［22］。
纹状体已被广泛证实在程序性学习记忆中发挥重要作用。应用CREB缺陷的转基因小鼠，在背侧纹状体中可逆地表达无活性的CREB变异体，发现在皮质纹状体相应部位的LTP及长时程抑制（long—term depression, LTD）均被抑制，并出现多种形式的纹状体相关的学习记忆功能障碍，提示CREB对皮质纹状体的突触双向可塑性也是必不可少的［23］。
3.2 增加沉默突触数量、新的突触连接生成 有一类突触由于突触后膜只表达NMDA受体而缺乏（或未检测到）AMPA受体，即只有突触结构而没有信息传递功能的突触，即为沉默突触。沉默突触是提供实践依赖型神经元联络的良好物质基础，更多的沉默突触可增加NMDA受体介导的突触反应并增强LTP幅度，对长时程突触可塑性与记忆的巩固可能异常重要。这种沉默突触在静息膜电位下处于功能性静止，在LTP期间突触胞浆膜中插入AMPA受体而转化为有功能的突触，这种转化可能是突触成熟及学习和记忆的基础。
在体内重组表达活性形式的CaMKⅣ与CREB，使NMDA受体介导的突触反应及LTP（幅度与持续时间）增强，应用激光共聚焦对神经元二级树突尖部进行三维重建，还发现每单位树突长度上树突棘数量显著增加；电生理、形态学技术均一致地显示新的沉默突触的产生。因此CREB活化的重要结果之一可能就是突触结构的可塑性［18］。
应用培养的单一的双向海兔感觉神经元与2个空间上独立或分离的运动神经元形成突触，在突触上预灌注五羟色胺使其到达运动神经元上，发现单一轴突分支可形成长时间分支特异性的易化，后者依赖于CREB磷酸化介导的转录，促使新的突触链接的生成［24］。
3.3 CREB磷酸化与神经元竞争、选择 竞争是许多生物系统的基本属性，在个体间产生选择性压力。在发育过程中，神经元之间的竞争是必不可少的，CREB参与发育中的脑组织神经元之间的竞争［25］；在某种记忆过程中，只有部分合适的神经元参与其中［26］，提示神经元之间的竞争可能也是成年脑组织可塑性的机制，即对成年脑组织，选择神经元参与编码记忆也是学习记忆的重要机制。
外侧杏仁核（lateral amygdala，LA)神经元可塑性是听觉相关性恐惧记忆的必要条件。虽然约70%LA神经元得到传入信息，但只有1/4神经元存在听觉条件诱导的可塑性，同时，相同比例的LA神经元出现CREB活化，即CREB促使那些神经元被选择参与学习记忆过程。CREB功能缺陷的转基因小鼠表现为发育中及成年脑组织的神经元可塑性障碍，出现包括听觉相关的恐惧记忆功能明显减退，予内源性CREB（功能正常的CREB）微注射于LA后相应的记忆障碍得到恢复，证明CREB可以增加神经元的兴奋性，使神经元被选择进入记忆过程［27］。
3.4 CREB磷酸化与神经元发育、分化、存活 在海马前体细胞瘤株H19—7细胞的体外实验中证实，CREB磷酸化后，促使CREB介导的下游基因转录而介导了中枢神经系统海马前体细胞的神经元分化［28］。动物实验表明CREB磷酸化与神经元分化平行，表现为在小鼠神经元切线方向迁移的晚期阶段增高并在树突伸长及棘突形成后下降；在体外抑制CREB功能可引起神经元形态学分化障碍；而缺乏CREB的转基因小鼠出现新生神经元存活下降［29］。即使在成年动物，CREB磷酸化对哺乳动物脑组织神经元的存活也是必不可少的［30］。其他多个重要实验也证实CREB对神经元存活的异常重要的作用：脑内CREB功能减退将导致成熟神经元出现显著凋亡，海马及背外侧纹状体神经元退行性变、轴突生长与投射障碍［31—32］。
作为在学习记忆中研究最为深入的细胞转录因子，CREB在学习记忆过程中的重要作用已得到充分的肯定。提高CREB活性或功能有望成为改善学习记忆功能的新途径，甚至可能改善正常衰老相关的学习记忆功能下降［33］。同时也有关于CREB参与学习记忆过程的不同甚至相反的结论：（1）部分学者认为许多研究多关注于某种形式如CREBα的基因删除，如果在海马产生所有形式的CREB（包括CREBδ、CREBα等）完全降低或删除，使脑内表达CREB的神经元减少70%～80%，未测到海马LTP/LTD障碍及海马依赖型的学习功能异常［34］；提示在海马CA1区20%～30%神经元保留完整的CREB水平即可保证正常的空间记忆，或者可能是由于不同形式的CREB对学习记忆起相反的调节作用而相互抵消了CREB对学习记忆的影响。（2）在小鼠海马脑片部分CREB突变形式并不影响某些形式的L—LTP（如theta—burst L—LTP)［35］；提示CREB对不同形式的L—LTP可能存在不同的效应。（3）不同脑区对其CREB活化反应不同：同样的下游靶基因在不同脑区可出现不同量的表达，或者表达不同靶基因，不同脑区的CREB磷酸化对学习记忆功能调节作用也不同，甚至部分脑区在某些条件下CREB的磷酸化对学习记忆起抑制作用［23，36］；提示CREB作用可能有种属或脑内区域特异性，或存在CREM等其他转录因子的代偿性上调等外来机制。客观上，许多研究设计的实验条件也影响对CREB作用的判断，在CREB与多种形式的突触可塑性等研究中需要对实验条件更严格的把握及实验结果的周密分析。