高氧肺损伤中肺细胞凋亡及JNK信号通路调控机制

作者：胡兰，许峰，李静，方芳，匡凤梧，王兴勇，卢仲毅。

【摘要】 目的： 观察高氧暴露下肺组织细胞凋亡和磷酸化cJun氨基末端激酶（pJNK）蛋白表达的变化，并探讨JNK信号转导通路对高氧诱导的肺细胞凋亡的调控机制. 方法： 48只3 wk龄Wistar大鼠随机分为空气对照组、高氧暴露3，7，14 d组、空气＋JNK抑制剂干预组、高氧暴露7 d＋JNK抑制剂干预组. 光镜下观察肺组织病理学改变，末端标记法（TUNEL）分析肺组织细胞凋亡的变化，免疫组化检测肺组织pJNK的表达分布，Western Blot检测肺组织pJNK蛋白质的表达含量. 结果： 与空气对照组比较，高氧暴露各时间点组肺组织出现典型急、慢性肺损伤的病理学改变，肺组织细胞凋亡指数和pJNK蛋白表达含量均显著增加（P0.05），肺组织pJNK阳性细胞明显增多. JNK抑制剂SP600125在空气和高氧暴露下均能明显阻断JNK的激活（P0.05），SP600125干预后高氧暴露肺组织细胞凋亡指数显著减少（P0.05）. 结论： 细胞凋亡是高氧肺损伤的一个重要病理组织学特点. JNK信号转导通路在高氧肺损伤中被激活，可能发挥促细胞凋亡效应.

【关键词】 cJun氨基末端激酶；氧/毒性；肺/损伤；细胞凋亡。

0引言。

氧疗是临床上用于改善组织缺氧状态的一种常用治疗手段，然而长时间持续吸入高浓度氧，可致活性氧(reactive oxygen species，ROS)大量产生，导致肺氧化应激性损伤［1—2］. 近年来研究［1—3］表明细胞凋亡可能是高氧肺损伤的一个重要组织学特点. cJun氨基末端激酶(CJun NH2terminal kinase，JNK)信号转导通路是丝裂原活化蛋白激酶(motigenactivated protein kinases，MAPKs)家族中的重要通路之一［4］，其在体内是否参与了高氧肺损伤的发病机制并介导高氧诱导的肺细胞凋亡，目前还少见报道. 我们以幼年Wistar大鼠为研究对象，观察高氧下肺组织细胞凋亡及磷酸化JNK(pJNK)蛋白表达的变化，以探讨JNK信号转导通路对高氧诱导的肺细胞凋亡的调控机制.

1材料和方法。

1.1材料清洁级3 wk龄Wistar大鼠48只,体质量40～50 g，雌雄不限（重庆医科大学动物中心提供）. 原位细胞凋亡检测试剂盒（德国Roche公司）；SP600125(美国Sigma公司)；pJNK兔多克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司)；磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)mAb（上海康成生物工程有限公司）；powervisionTM twostep 免疫组化检测试剂盒和辣根过氧化酶（HRP）标记山羊抗兔IgG（北京中杉金桥生物技术有限公司）；二辛可宁酸（BCA）蛋白定量检测试剂盒（上海生工生物工程有限公司）；聚偏二氟乙烯（PVDF）膜（BioRad公司）；增强化学发光法（ECL）试剂盒（美国Pierce化学品公司）.

1.2方法。

1.2.1动物分组及高氧模型制备采用随机数字表法将48只大鼠分为空气对照组、高氧暴露3，7，14 d组、空气＋JNK抑制剂干预组、高氧暴露7 d＋JNK抑制剂干预组6组（n=8）. 将高氧组置于有机玻璃氧仓中，连续行吸入氧体积分数（FiO2）监测，保证FiO2≥950 mL/L；空气对照组置于同室空气中（FiO2=210 mL/L）；JNK抑制剂SP600125干预组动物经腹腔注射SP600125 30 mg/kg，药物一次性给予，给药2 h后予高氧或空气暴露7 d. 各组环境温度控制在21℃～25℃，湿度50%～60%, 并于每日09∶00开箱10 min，清洁有机玻璃氧仓，添加饲料及饮水.

1.2.2标本采集空气对照组（空气暴露第7日取标本）、高氧暴露组（分别在高氧暴露第3，7，14日取标本）、JNK抑制剂干预组（分别在干预后再空气暴露和高氧暴露第7日取标本）动物以35 mL/L水合氯醛（10 mL/kg）腹腔麻醉，开胸，结扎右中肺，剪左心耳，于右心室注入含肝素的生理盐水灌洗肺循环血管，直到左心房流出的液体清亮为止. 分离肺组织，生理盐水漂洗干净，滤纸吸干水分，右中肺经40 g/L多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，5 μm切片，HE染色，光镜下检查肺组织病理变化；同时行细胞凋亡检测及免疫组化检测. 其余部分置于—70℃冰箱保存，行pJNK Western Blot检测.

1.2.3肺组织细胞凋亡检测采用TUNEL检测. 切片脱蜡至水，加入蛋白酶K工作液，21℃～37℃反应15～30 min，30 mL/L H2O2室温下（15℃～25℃）封闭10 min，滴加50 μL TUNEL反应混合液（酶反应液与标记液的比例为1∶9）湿盒中37℃避光湿润反应1 h，再滴加50 μL ConverterPOD,湿盒中37℃避光湿润反应30 min，DAB显色，苏木素复染，脱水，透明，封片. 结果判断和图像分析： 胞核呈现棕黄色为阳性细胞. 每张切片随机选5个高倍镜(×400)非重叠视野，应用北航病理真彩色图像软件分析系统CM2000B，记数每个视野的凋亡指数（阳性细胞数/总细胞数×100％），再求均值.

1.2.4pJNK在肺组织中表达和分布的检测采用二步法免疫组化检测. 切片脱蜡至水，30 mL/L H2O2封闭内源性过氧化物酶5～10 min，热修复抗原，血清封闭20 min，滴加一抗（1∶100），4℃过夜，二抗为HRP标记山羊抗兔IgG（1∶1000），37℃孵育20 min，DAB显色，苏木素轻度复染，脱水，透明，封片. 结果判断：胞核和/或胞质呈现棕黄色为阳性细胞.

1.2.5pJNK蛋白含量检测采用Western Blot方法检测. 改良RIPA裂解液(mmol/L)（TrisHCl 50，NaCl 150，EDTA 1，NaF 50，Na4P2O7 2.5，Na3VO4 1，Triton X100 10 mL/L，甘油100 mL/L，SDS 1 g/L，脱氧胆酸钠5 g/L，leupetin 100 μmol/L，PMSF 1）提取肺组织总蛋白（每100 mg组织加入0.5 mL裂解液）， BCA比色法定量. 取100 μg待测蛋白按序加样，SDSPAGE电泳后100 V 4℃转移至PVDF膜上，50 g/L脱脂牛奶常温下封闭1 h，滴加一抗pJNK（1∶1000 ）4℃孵育过夜，HRP标记的二抗（1∶2500）常温孵育1 h，ECL化学发光曝光5 min，由ChemiDocXRS图像采集系统（美国BioRad公司）采集图像. 结果分析采用Quantity One 4.5.0软件读取各个目的蛋白条带的校正积分光密度值，以GAPDH作为内参照，pJNK蛋白含量用ApJNK /AGAPDH表示.

统计学处理：实验数据以x±s表示，用SPSS13.0统计软件进行分析，多样本均数比较用单因素方差分析，组间两两比较用LSDt检验，P0.05为差异有统计学意义.

2结果。

2.1肺损伤病理学观察空气对照组及空气＋JNK抑制剂干预组肺组织结构无明显异常. 高氧暴露3及7 d组肺泡上皮细胞肿胀，肺泡壁增厚，肺间质充血、水肿，炎性细胞浸润，肺泡结构紊乱，尤以高氧暴露7 d组更明显. 高氧暴露14 d组肺内炎性渗出减少，水肿减轻，肺间质及成纤维细胞增生明显. 高氧暴露7 d＋JNK抑制剂干预组较高氧暴露7 d组肺泡结构紊乱有所改善，肺泡壁增厚及肺间质充血、水肿减轻，炎性细胞浸润减少.

2.2肺组织细胞凋亡的变化及分布空气对照组及空气＋JNK抑制剂干预组肺组织中均少见TUNEL阳性细胞，两者凋亡指数比较无显著性差异（P0.05）. 而高氧暴露3，7，14 d组肺组织中可见大量的TUNEL阳性细胞，其凋亡指数均显著高于空气对照组（P0.05），尤以高氧暴露3，7 d明显，高氧暴露14 d稍有回落. 高氧暴露7 d＋JNK抑制剂干预组较高氧暴露7 d组肺组织TUNEL阳性细胞则明显减少，两者凋亡指数比较有显著性差异（P0.05，表1）. 凋亡细胞主要见于肺泡上皮细胞、小气道上皮细胞及血管内皮细胞，部分巨噬细胞及间质细胞也呈凋亡改变.

表1各组肺组织细胞凋亡指数及pJNK蛋白含量的相对变化（略）。

aP0.05 vs 空气对照； cP0.05 vs 高氧7 d； eP0.05 vs 高氧14 d.

2.3pJNK阳性细胞在肺组织中表达和分布的变化空气对照组肺组织偶有少量pJNK阳性细胞表达，高氧暴露各组肺组织阳性细胞则明显增多，以高氧暴露7 d组增多最为明显. 空气＋JNK抑制剂干预组较空气对照组肺组织阳性细胞稍有减少，高氧暴露7 d＋JNK抑制剂干预组较高氧暴露7 d组肺组织阳性细胞明显减少. 阳性细胞广泛分布于肺泡上皮细胞、小气道上皮细胞、血管内皮细胞、巨噬细胞、间质细胞及浸润炎症细胞（图1）.

2.4肺组织pJNK蛋白表达含量的变化空气对照组肺组织仅有少量pJNK蛋白表达，高氧暴露3，7，14 d组肺组织pJNK蛋白表达含量显著增加. 空气＋JNK抑制剂干预组及高氧暴露7 d＋JNK抑制剂干预组肺组织pJNK蛋白表达含量较相应未干预组均显著减少（P0.05，图2，表1），表明JNK抑制剂SP600125在空气和高氧下均能特异性阻断JNK的激活.