人类免疫缺陷病毒—1 nef诱导凋亡及下调人类白细胞抗原—I类分子
作者：黄官友， 黄秀艳， 曾耀英， 曾祥凤， 吴晓萍。
【摘要】 【目的】 研究人类免疫缺陷病毒(HIV)—1 nef 调节细胞表面的人类白细胞抗原(HLA)—I类分子及诱导细胞凋亡情况。【方法】 将293T细胞分为两组，用脂质体法将含HIV—1 nef基因的质粒及空载体分别转染细胞，Western blot检测HIV—1 nef在转染细胞中的表达，荧光抗体染色结合流式细胞术检测细胞表面的HLA—I类分子表达及细胞凋亡情况。【结果】 HIV—1 nef在转染细胞中有表达。转染HIV—1 nef的细胞与转染空载体的细胞经抗HLA—A，B，C—FITC染色后，平均荧光强度分别为205±22及269±15，两者相比有显著性差异（P 0.01）； 经Annexin V—APC/PI染色后，阳性细胞百分率分别为（60.82±8.32）%及（8.12±5.43）%，两者相比亦有显著性差异（P 0.01）。【结论】 HIV—1 nef下调细胞表面的HLA—I类分子及诱导细胞凋亡。
【关键词】 人类免疫缺陷病毒—1 nef； 人类白细胞抗原—I类分子； 凋亡； 转染。
人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus，HIV）是引起艾滋病即获得性免疫缺陷综合症的病原体。HIV 主要型别分为HIV—1和HIV—2，我国艾滋病大多由HIV—1引起，一些逆转录酶抑制剂、蛋白酶抑制剂，融合抑制剂及某些中药[1]等均具有抗HIV—1的作用。在HIV—1感染的患者中，疾病的进展与凋亡，特别是辅助性 T细胞的凋亡呈负相关。大量研究表明，HIV—1的附属蛋白Tat,Vpr,Vpu及Nef 参与调节细胞的凋亡[2]。其中，HIV—1 nef 参与调节细胞的凋亡颇受重视。目前一致认为，HIV—1 nef能够诱导旁观者细胞的凋亡[3,4]，而对HIV—1感染或转染HIV—1 nef 的细胞，多数学者认为HIV—1 nef 抑制该细胞的凋亡[3,5—8]，而少数学者则得出相反的结论[9,10]。因此，对HIV—1感染或转染HIV—1 nef 的细胞，HIV—1 nef 是促进或抑制其凋亡，尚需进一步研究。此外，有报告显示HIV—1 通过其nef 下调细胞表面的主要组织相容性复合体(major histocompatibility complex, MHC) I类分子而逃避宿主细胞毒T细胞（cytotoxic T cell, CTL）的攻击而保护感染细胞[11]。由于细胞凋亡是程序性细胞死亡，而HIV—1 nef 下调细胞表面的MHC I类分子意味着这种HIV—1 蛋白保护感染细胞免受死亡。从导致死亡的角度来说，细胞凋亡和细胞表面MHC I类分子的下调互为矛盾。对于转染HIV—1 nef 的细胞，是否同时具备细胞凋亡及细胞表面MHC I类分子下调的特性，本文作一定的分析。
1 材料和方法。
1.1 材料。
SVCMV 载体及SVCMV nef质粒为加拿大Manitoba大学Xiaojian Yao教授所赠。脂质体LipofecfamineTM 2000购自Invitrogen,抗HIV—1 nef抗体购自Santa Cruz公司，辣根过氧化物酶标记的马抗山羊IgG购自北京鼎国生物技术有限公司，化学发光底物Supersignal West Pico Kits 购自Pierce公司，PVDF膜购自Roche公司，RIPA buffer 购自Sigma公司，抗人HLA—A，B，C—FITC单克隆抗体及膜联蛋白（Annexin V）—APC均购自BD公司，DMEM及胎牛血清（FBS）均购自GIBCO公司，FACSCalibur流式细胞仪购自Becton Dickinson公司。293T细胞为本实验室自备。
以含10%FBS和DMEM培养293T细胞。DNA的脂质体转染法按Lipofectamine TM 2000的说明书所示进行操作，即：①在转染前一天铺细胞，注意每盘细胞中所放置的细胞的数量要相等，所加培养液的量要一致。转染时细胞达覆盖生长面的50%~70%，②准备A液（脂质体+无血清的DMEM，两者比例为10 μL ∶ 250 μL）及B液（DNA+无血清DMEM，两者比例为4 μg : 250 μL）分别混匀后室温下静置5 min，然后混合A液与B液，室温下静置20 min，其中，DNA与脂质体的比例为4 μg : 10 μL；④将待转染细胞的培养液换为无血清DMEM，吸取A，B混合液，逐滴滴入含待转细胞的培养液中，注意每盘细胞中所加的DNA量要相同。4 ~ 6 h后，以含10%FBS的DMEM换液。转染48 h收集、计数细胞，取3×106细胞作Western blot，取0.5×106 细胞作流式细胞术分析。
1.3 Western blot 测定HIV—1 nef的表达。
收集转染48 h的细胞离心（120 × g, 5 min），吸弃上清液，加入40 μL RIPA butter，混匀后置冰上，30 min后，4 ℃离心（13 400 × g, 20 min），取上清液，加入点样缓冲液，沸水浴5 min，点样，样品在含12.5%的聚内烯酰胺（PAGE）凝胶中电泳。电泳后将PAGE凝胶中的蛋白通过电转移槽转至PVDF膜。用3%的脱脂乳封闭已转PVDF膜2 h，继后加入一抗anti—HIV nef （PBS 1∶ 400稀释），4 ℃封闭过夜后，用PBS洗膜5次，每次5 ~10 min。洗膜后加入二抗辣根过氧化物酶标记的马抗出羊IgG（PBS 1 ∶ 500稀释），室温下缓慢振荡1 h，再用PBS洗膜5次，每次5 ~10 min，最后用化学发光试剂盒显色、曝光，对HIV—1 nef的表达进行检测。
1.4 荧光抗体染色结合流式细胞术检测细胞表面的HLA—A，B，C分子及测定细胞凋亡。
取转染48 h细胞, 离心（300 × g，5 min），弃上清液，PBS洗涤细胞后再离心，去掉上清液。若检测细胞表面的HLA—A，B，C分子的表达，将细胞重悬于300 ?滋L PBS中，加入抗人HLA—A，B，C—FITC 1.0 ?滋g，混匀后室温避光静置25 min，PBS洗涤一次，弃上清，将细胞重悬于300 ?滋L PBS中，立即上机检测；若测定细胞凋亡，将细胞重悬于300 ?滋L染料结合缓冲液中，振荡混匀，加入5 ?滋L Annexin V—APC，混匀后室温避光静置15 min，然后，加入5 ?滋L的PI，混匀后再作用5 min，立即上机检测。全部数据经FACSCalibur流式细胞仪和CELLQuest软件获取并分析。FITC为荧光1（FL1），PI为荧光2（FL2）,APC为荧光4（FL4）。
1.5 统计学方法。
实验结果用统计软件包SPSS 10.0进行处理，数据以ｘ±ｓ表示，多组间相比采用One way—ANOVA，两组间比较用t检验。