胰岛素样生长因子1对脊髓源性神经干细胞定向分化的影响

作者：张殿君 刘一 付长峰 宿小云 李相军 韩宏志。

【摘要】 目的 探讨胰岛素样生长因子1（IGF1）在脊髓源性神经干细胞定向分化中的作用。方法 分离新生24 h的大鼠脊髓源性神经干细胞，用脂质体法将构建的重组载体pCDNA3.1GFPIGF转染至细胞内，光学显微镜观察细胞凋亡及分化情况。 结果 转IGF1基因的脊髓源性神经干细胞可在无生长因子的培养基内增殖，并向神经元细胞分化。结论 IGF1可在体外抑制脊髓源性神经干细胞的凋亡，并定向诱导脊髓源性神经干细胞向神经元细胞方向转化。

【关键词】 神经干细胞；脊髓源性；胰岛素样生长因子1；细胞分化。

脊髓损伤后可导致较高的致残率，但医学上尚未找到较好的治疗方法。脊髓源性神经干细胞的发现为中枢神经系统损伤后的再生治疗提供了新的途径〔1，2〕。作为成体干细胞，这些细胞通常处于静止状态，只有损伤后才表现为增生活跃，但多分化为星形胶质细胞，参与胶质瘢痕的形成，因此神经干细胞定向诱导分化成为当今研究的热点〔3～5〕。有研究表明，胰岛素样生长因子1（IGF1）具有抑制脊髓损伤后神经元凋亡的作用〔6～8〕。为此，本研究拟通过基因转染技术，建立转IGF1基因脊髓源性神经干细胞，研究IGF1对脊髓源性神经干细胞分化的影响，探索治疗脊髓损伤的有效途径。

1 材料与方法。

1.1 实验材料 DMEM /F12 (1∶1)培养基，B27添加剂，胎牛血清购自Gibco公司；表皮细胞生长因子(EGF) ，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)购自Sigma公司；脂质体2000购自Invitrogen公司；新生24 h内的Wistar 大鼠（SPF级）由吉林大学动物室提供；重组载体pCDNA3.1GFPIGF由本实验室自行构建并保存。

1.2 方法。

1.2.1 神经干细胞的分离和传代培养 新生Wistar大鼠断颈处死后，无菌条件下取出脊柱，用1 ml注射器吸取1 ml无血清DMEM /F12培养基，从脊柱一端进针充分冲出脊髓组织，不锈钢筛网进行碾压，分离单个细胞。用神经细胞培养液（DMEM /F12为基础培养基，B27添加剂终浓度为1%， bFGF和EGF终浓度均为20 ng/ml）调节细胞终浓度为2×105，接种到10 cm平皿，37℃、5% CO2培养箱中进行培养。

1.2.2 转IGF1基因脊髓源性神经干细胞的建立 将传代培养细胞接种于6孔培养板中，贴壁细胞达60%～70%时，常规脂质体法进行转染。转染后48 h，将细胞消化传代至10 cm平皿中，用含G418（600 μg/ml）的DF完全培养基进行筛选，含300 μg/ml G418的完全培养基维持培养。

1.2.3 IGF1对神经干细胞的作用 将上述脊髓源性神经干细胞及转IGF1基因脊髓源性神经干细胞分别消化传代，接种于6孔培养板中，培养基内去除生长因子（bFGF/EGF/B27），继续培养48 h。光学显微镜观察细胞增殖及分化情况。

2 结 果。

2.1 转基因脊髓源性神经干细胞的建立 本研究选择了脂质体2000，将重组质粒和脂质体混匀形成复合体，然后转染到细胞中，24 h后荧光显微镜下观察转染情况（图1）。

2.2 转基因与非转基因脊髓源性干细胞的增殖与分化 倒置相差显微镜观察转基因前后细胞增殖分化的变化（图2）。由图中可以看出未转染IGF1的神经干细胞在去除生长因子的培养基中难以维持增殖（图2），48 h后细胞发生凋亡（图2）；而转IGF1基因神经干细胞可维持克隆样生长（图2），并向神经元细胞方向分化（图2）。